Главная

Материалы и оборудование

Среду для культивирования клеток RPMI-1640 (SIFIN, Берлин) разводят бидистиллированной водой и вносят следующие добавки:
бикарбонат натрия — 2 г/л (х.ч.),
20 мМ ГЭПЭС (N-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновая кислота, х. ч.),
2 мМ L-глутамина (отбирают из замороженного маточного 200 мМ раствора),
5х10^-5 М 2-меркаптоэтанола (х. ч., из 0,1 М маточного раствора),
100 мг/л гентамицина (Фармахим, София).

Раствор стерилизуют и добавляют по 100 мл стерильной сыворотки плода коровы (SIFIN, Берлин) на 1 л среды. В таком виде среда может храниться в течение 6 недель при 4°С. При работе с надежными клеточными культурами можно заменять фетальную сыворотку коров, неонатальной сывороткой или в некоторых случаях нормальной лошадиной сывороткой. Вместо гентамицина можно использовать смесь пенициллина и стрептомицина.

Среда для слияния клеток: к среде RPMI-1640 добавляют 2 г/л бикарбоната натрия, 20 мМ ГЭПЭС и 100 мг/л гентамицина; сыворотку не добавляют.

Селективная среда гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) состоит из полной среды для культивирования, к которой добавлено 20 мл/л стерильного маточного раствора ГАТ. Конечные концентрации компонентов: 1х10^-4 М гипоксантина, 4х10^-7 М аминоптерина, 1,6х10^-5 М тимидина. Среда ГТ (гипоксантин, тимидин) состоит из полной культуральной среды, к которой добавлено 10 мл/л стерильного маточного раствора ГТ.

Приготовление маточных растворов ГТ и ГАТ: в дистиллированной воде растворяют хроматографически чистый гипоксантин (Реанал, Будапешт) до концентрации 1х10^-2 М путем нагревания при 45—50 °С в течение 1 часа. К этому раствору добавляют тимидин (Sigma, Мюнхен) до конечной концентрации 1,6х10^-3 М. Этот 10-кратный раствор (ГТ) фильтруют в стерильных условиях и хранят при температуре —20 °С.

Раствор аминоптерина 4х10^-5 М получают путем добавления 1,76 мг аминоптерина (Schuchardt, Мюнхен) и 0,5 мл 1 М NaOH к 90 мл дистиллированной воды. Доводят объем дистиллированной водой до 100 мл, нейтрализуют раствор 0,5 мл 1 М HCl и фильтруют в стерильных условиях.

ГАТ (50-кратный раствор) готовят смешиванием растворов ГТ и аминоптерина в соотношении 1 : 1, раствор разливают по 2 мл и хранят при —20 °С. Следует защищать растворы, содержащие аминоптерин, от действия света.

Раствор ПЭГ: 5 г полиэтиленгликоля (относительная молекулярная масса 1540, ф. ч. Polyscience Inc., США, или относительная молекулярная масса 4000 чист, для газовой хроматографии, Merck, Дармштадт) смешивают с 5 мл культуральной среды для слияния, одновременно растворяют и стерилизуют автоклавировани-ем в течение 20 мин. Непродолжительное время раствор полиэтиленгликоля может храниться при 4°С. Для длительного хранения раствор лучше замораживать. Посуда для культивирования:

— микропланшеты для титрования с плоским дном и крышкой 96X200 мкл (Flow Labs, ФРГ);

— планшеты для культуры тканей с плоским дном и крышкой 24X2 мл (Linbro);

— пластиковые культуральные сосуды (5, 25, 50 мл).

Кроме того, необходимы: стеклянные пипетки (1, 2, 5 и 10 мл), пастеровские пипетки, автоматические пипетки и выдерживающие автоклавирование сменные наконечники к ним (тип 1 и 2), центрифужные стаканы (10 и 25 мл).

Вся посуда, применяемая для работы с культурой ткани, должна быть стерильна. Прочие материалы и посуду для стерильных манипуляций и подсчета клеток смотри в разделе "Образование антител культурами клеток". Оборудование: ламинарный бокс (VEB, Electromat, Дрезден), СО₂-инкубатор, устройство для стерильной фильтрации (мембранные фильтры), инвертированный микроскоп Telaval (VEB, Карл Цейсс, йена), водоструйный насос, центрифуга с охлаждением (К24).