| |
Главная |
Титрование комплемента. МетодикаМатериалы и оборудование Растворы: Оборудование: Подготовка сыворотки для исследования Забор крови проводят без антикоагулянтов, пробе дают постоять 1 час при комнатной температуре, центрифугируют (10 минут при 1000 g) и отделяют сыворотку. Рекомендуется проводить титрование комплемента сразу после получения сыворотки. Если это не удается, то сыворотку ввиду термолабильности комплемента рекомендуется хранить в шкафу глубокого охлаждения (—80 °С). Применение плазмы в данном случае не дает никаких преимуществ. После разведения сыворотки калий-боратным буфером в отношении 1 + 2 ее можно хранить в течение нескольких недель при 4°С без потери активности комплемента. Этот метод консервации применяют довольно часто. Для определения гемолитической активности в агарозе пробы сыворотки хранят в течение 24 часов при 4°С. Получение суспензии эритроцитов барана ЭБ трижды отмывают в рабочем буфере (центрифугируют 10 минут при 650 g), из отмытых эритроцитов готовят 4% суспензию. Это соответствует 6,5х107 клеток в 1 мл. Концентрацию суспензии определяют фотометрически и устанавливают оптическую плотность (ОП) 0,375. Для этого 0,2 мл суспензии ЭБ лизируют добавлением 4,8 мл дистиллированной воды и определяют ОП против дистиллированной воды. Конечный объем суспензии рассчитывают по формуле:
где VE — конечный объем суспензии, VA — исходный объем суспензии Титрование гемолизинов Титрование гемолизинов проводят в пробирках. В каждую из 8 пробирок вносят по 0,5 мл рабочего буфера. В первую пробирку вносят 0,5 мл гемолизина в разведении 1 : 100. Делают геометрический ряд разведений, перенося по 0,5 мл содержимого первой пробирки в пробирки 2—8. Добавляют 0,5 мл суспензии ЭБ и инкубируют 30 минут при 37°С. Затем в каждую пробирку вносят по 5,5 мл рабочего буфера и по 1,0 мл сыворотки морской свинки, разведенной в соотношении 1 : 200. После повторной инкубации в течение 60 минут при 37°С пробирки центрифугируют (10 минут, 800 g) и измеряют ОП надосадочной фракции. С увеличением концентрации гемолизинов (уменьшение разведения сыворотки) гемолиз (ОП) возрастает, * достигая плато. Наибольшее разведение гемолитической сыворотки, при котором ОП все еще (находится на плато, называется гемолитической единицей. В коммерческих препаратах она составляет от 1 : 4000 до 1 : 6000. Титрование можно также проводить в микротитраторе (планшет Takatsy) аналогичным образом. Каждая новая партия гемолизинов должна тестироваться с одинаковыми реагентами, контроль следует проводить один раз в 14 дней. Сенсибилизация эритроцитов барана К 1 объему суспензии ЭБ добавляют равный объем разведенной гемолитической сыворотки, содержащий 4 гемолитические единицы. Тщательно перемешивают жидкости и инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Во время инкубации смесь несколько раз встряхивают. Сенсибилизированные эритроциты должны быть использованы в тот же день, до использования их хранят при 4°С. Сенсибилизированные ЭБ называются гемолитической системой, которую используют как для титрования комплемента в пробирке, так и для гемолиза в агарозе. Гемолиз в агарозе Постановка опыта. Получают 2% золь агарозы в рабочем буфере и охлаждают его до 50 °С. Затем на водяной бане (48°С) смешивают равные объемы агарозы и сенсибилизированных ЭБ, предварительно нагретых до этой температуры. Суспензию постепенно заливают между двумя стеклами, имеющими зазор 1,5 мм. Мы использовали пластины 100х200х3 мм, между которыми вмещалось 23 мл агарозы. После охлаждения одну из пластин удаляют и в геле проделывают специальным штампом по шаблону отверстия диаметром 3 мм на расстоянии 15 мм друг от друга (всего до 60 отверстий). В каждое отверстие вносят по 5 мкл неразведенной сыворотки. Пластину инкубируют 18 часов при 4°С для того, чтобы прошла диффузия, и еще 2 часа при 37 °С для того, чтобы произошел гемолиз. После чего зоны гемолиза становятся хорошо различимыми на свету. Для консервации гелей их заворачивают в слой фильтровальной бумаги, смоченной физиологическим раствором (без образования под бумагой пузырей воздуха), насыпают сверху слой целлюлозы толщиной 1 см и кладут груз с таким расчетом, чтобы масса 10 г приходилась на 1 см2. Через 15 минут груз снимают, убирают целлюлозу и бумагу, высушивают гель на воздухе. Пластины для гемолиза можно сохранять при 4°С в течение 3—4 дней без ущерба для качества анализа. Оценка результатов. Зоны гемолиза оценивают визуально, иногда со слабым увеличением. Пластины с гелем можно фотографировать. Величина зоны гемолиза пропорциональна активности комплемента. Используя стандарты и разведения исследуемой пробы, можно оценивать процесс количественно. Мы использовали гемолиз в агарозе для полуколичественной оценки в качестве ориентировочного анализа. Титрование комплемента Постановка опыта. Исследуемая сыворотка разводится рабочим буфером в отношении 1 + 2. Если сыворотка уже разведена калий-боратным буфером, то разведения рабочим буфером уже не требуется. Разведенную сыворотку в количестве 0,5 мл смешивают с 2,55 мл рабочего буфера, что соответствует разведению 1 : 12,2. В остальных пробирках готовят ряд разведений в соответствии с таблицей: Схема титрования комплемента
В пробирку № 12, где должен быть 100% гемолиз, добавляют следовые количества сапонина. Все пробы инкубируют на водяной бане в течение 45 минут при 37°С. Затем центрифугируют 10 минут при 800 g и измеряют оптическую плотность надосадочной фракции в 11-й пробирке (0% гемолиз). Обработка результатов. Результаты определения ОП корригируют по значению ОП контроля (пробирки 11 и 12). Рассчитывают процент гемолиза. Для построения графической зависимости используют логарифмическую бумагу. Значение каждого разведения сыворотки (12,2, 15,2, 18,5 и т. д.) отмечают на оси абсцисс. На оси ординат откладывают соответствующий процент гемолиза. Получаемые точки соединяют и по графику тут же определяют разведение сыворотки, при котором наступает 50% гемолиз. Число гемолитических единиц в 1 мл сыворотки рассчитывают по формуле:
а — фактор первоначального разведения сыворотки (равен
12,2), |
