| |
Главная |
Реакция торможения адгезии лейкоцитов. МетодикаМатериалы и оборудование Растворы для сепарирования клеток: среда Игла, раствор Хенкса, изотонический буфер с рН 7,3 (Институт иммунных препаратов и питательных сред, Берлин), гепарин, лимфопреп (Nyegaard, Норвегия) или фиколл — гипак (Pharmacia, Швеция). Оснащение для приготовления антигенов: гомогенизатор, ультрацентрифуга, диализные мешки. Посуда: сосуды с частично плоской поверхностью (ЗОХ Х13 мм), пластиковые сосуды с плоским дном, микропланшеты (например, Falcon N 3034). Подсчет клеток: камеры для подсчета клеток (Biirker, Thoma и др.); микроскоп, прибор для счета клеток (например, Picoscale, Medicor, Венгрия); кроме того, необходимы термостат, центрифуги и различная стеклянная посуда. Приготовление клеток В РТАЛ можно использовать как лейкоциты, так и лимфоциты. Мы предлагаем следующую простую модификацию: отслоив-шуются после спонтанной седиментации гепаринизированной крови (30-40 мл) плазму наслаивают на лимфопреп. После центрифугирования (20 мин, 150 g) слой лимфоцитов, содержащийся между плазмой и лимфопрепом, отсасывают. Клетки трижды отмывают в изотоническом буфере и суспендируют в среде Игла. При работе с животными можно использовать клетки лимфатических узлов или перитонеалъного экссудата. Можно также использовать спленоциты. Перед подсчетом клеток необходимо лизировать эритроциты. Суспензию клеток лимфатических узлов и селезенки получают путем продавливания этих органов через тонкое металлическое сито или осторожного растирания в стеклянном гомогенизаторе. Фильтрованием через слой марли или капроновой сетки удаляют агрегаты клеток. Клетки человека выделяют при комнатной температуре, поскольку на холоду они склонны к агрегации. Препараты клеток мыши получают при 4°С. Антигены Антигенсодержащие экстракты из опухолевых, эмбриональных и других тканей выделяют различными методами. Широкое распространение получило экстрагирование ЗМ KCI, также используется выделение препаратов мембран и экстракция изотоническим раствором хлорида натрия. Для экстракции изотоническим раствором NaCl ткань измельчают ножницами, смешивают в соотношении 1 + 4 с буфером (ФСБ) и гомогенизируют (гомогенизатор Уорринга, Поттера или Ultra-Turrax). Центрифугируют 10 мин при 1000—3000 g, собирают надосадочную фракцию и центрифугируют 30 мин при 20 000 g (можно больше). Полученную прозрачную надосадочную фракцию замораживают небольшими аликвотами при —20 °С. Если после размораживания образуется нерастворимый осадок, его удалят центрифугированием. В качестве рабочей концентрации в РТАЛ используют разведение, которое дает значимые различия между пробами от сенсибилизированных и несенсибилизированных доноров. Для экстрактов тканей эта величина составляет в среднем 50—500 мкг белка на пробу. Проведение РТАЛ Метод «счетной камеры». Смешивают 106 лейкоцитов в 0,05 мл среды с 0,05 мл препарата АГ (в контроле просто среда) и с 0,1 мл нормальной сыворотки. Пробирки закрывают и инкубируют на водяной бане 30 мин при 37°С. Через каждые 5 минут содержимое пробирок встяхивают. После инкубации суспензию вносят в счетную камеру пастеровской пипеткой. Камеру выдерживают 1 минуту при 37 °С в водонасыщенной атмосфере (чашка Петри со смоченным куском фильтровальной бумаги). Подсчитывают клетки. В квадрате 0,2х0,2 мм должно содержаться 15—25 клеток. Подсчитывают клетки в 5 квадратах. Затем отмывают неадгезированные клетки (процедура требует особого навыка). Счетную камеру помещают в горизонтальном положении в сосуд с физиологическим раствором и осторожно снимают покровное стекло. Камеру бережно извлекают и на короткое время помещают в вертикальном положении в сосуд с изотоническим раствором. Затем в камеру добавляют 1 каплю среды и покрывают чистым покровным стеклом. Через 1—2 часа подсчитывают адгезированные клетки в тех же 5 квадратах, определяют процент адгезированных клеток. Адгезия лимфоцитов опухоленосителя в контроле без антигена (а), и в пробе с эмбриональным антигеном (б)
Добавлением исследуемой сыворотки (0,1 мл) вместо нормальной можно выявлять блокирующие или деблокирующие адгезию сывороточные факторы. «Пробирочный» вариант РТАЛ. Суспендируют 106 клеток совместно с АГ в конечном объеме 0,5 мл в специальном сосуде, имеющем частично плоскую поверхность, на которой он стоит. Клеток должно быть немного, чтобы не мог образоваться монослой лимфоцитов на плоской поверхности. После инкубации в горизонтальном положении (2 ч, 37 °С) сосуды ставят вертикально, осторожно ополаскивают плоскую поверхность суспензией клеток. После перемешивания суспензию переносят пастеровской пипеткой в счетную камеру и подсчитывают неадгезировавшие клетки. Схема постановки РТАЛ (подсчет неадгезировавших клеток)
Прочие модификации. Модификации, как правило, преследуют цель ускорить проведение анализа. Для этого индикаторные капли метят радиоактивными изотопами и применяют автоматизированный подсчет адгезированных и неадгезированных клеток ). Кроме того, РТАЛ проводят в микропланшетах или капиллярах с целью уменьшения расхода клеток или антигена. Микропланшеты можно анализировать даже при помощи соответствующей программы на ЭВМ. Подсчет результатов. В контрольных пробах смешивают лимфоциты несенсибилизированного донора со специфическим АГ, исследуемые лимфоциты со средой или с неспецифическим антигеном. Торможение адгезии (ТА) оценивают по следующей формуле:
Для оценки результатов «пробирочного» метода часто используют такой показатель, как индекс неадгезировавших клеток (ИНА).
Границу между специфическим и неспецифическим торможением адгезии устанавливают статистически или эмпирически по сравнению с реакцией лимфоцитов сенсибилизированных и несенсибилизированных доноров. |
