Главная

Выделение макрофагов из суспензии сплеиоцитов. Методика

а) Для получения спленоцитов и идентификации макрофагов: инбредные мыши различных штаммов, раствор Хенкса и среда Игла-МЕМ, сыворотка эмбрионов коров, раствор нейтрального красного и раствор туши (см. раздел "Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика."), ножницы, анатомические пинцеты, стеклянные чашки Петри (диаметром 5 и 12 см), силиконизированные пробирки, стеклянный антибактериальный фильтр G-5, алюминиевая фольга, стеклянные шприцы на 10 мл, стальные иглы № 18. центрифужные пробирки, силиконизированные на. 25 мл, пипетки для лейкоцитов и эритроцитов, камера Biirker, сухожаровой шкаф, термостат, настольная центрифуга, микроскоп.

Используемую стеклянную посуду очищают соответствующим образом (см. раздел "Образование антител культурами клеток"). Стерилизацию инструментов и стеклянной посуды, силиконирование стеклянной посуды см. в разделе "Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика.".

б) Для отделения макрофагов методом адгезии на чашках Петри: спленоциты, раствор Хенкса, среда Игла-МЕМ без гидрокарбоната, сыворотка эмбрионов коров, стеклянные шприцы на 10 мл, стальные иглы № 12, центрифужные пробирки на 25 мл, стеклянные чашки Петри диаметром 6 см, столик с подогревом, настольная центрифуга.

в) Для отделения макрофагов при помощи карбон ила железа: спленоциты, раствор Хенкса, сыворотка эмбрионов коров, карбонил железа порошкообразный, чистейший (Fluka, Швейцария), эрленмейеровские колбы (50 мл), силиконизированные, силиконовые пробки, градуированные пипетки, водяная баня, качалка, настольная центрифуга, магнит.

г) Для отделения макрофагов на сефадекс G-10: спленоциты; сефадекс G-10 (Pharmacia, Швеция), 10 г сефадекса замачивают на ночь в 40 мл 0,15 М NaCl, трижды отмывают порциями по 40 мл 0,15 М NaCl, суспендируют в 25 мл 0,15 М NaCl и автоклавируют 40 мин при 110°С; изотонический буфер (см. раздел "Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика."), перед употреблением к 1 л буфера добавляют 50 мл сыворотки эмбрионов коров и 20 мл раствора антибиотиков (см. раздел "Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика."); нейлоновая вата; кусочки льда; стеклянный шприц на 30 мл силиконизированный; стальные иглы № 14; лабораторный штатив; градуированные пипетки; 100-миллиметровые эрленмейеровские колбы; стакан на 400 мл; центрифужные стаканы на 25 мл; настольная центрифуга.

д) Для отделения макрофагов при помощи антимакрофагальной сыворотки: спленоциты, раствор Хенкса, антимакрофагальная сыворотка (АМС), сыворотка морской свинки (комплемент), градуированные пипетки, эрленмейеровские колбы на 50 мл силиконизированные, термостат, качалка, настольная центрифуга.

Получение суспензии спленоцитов

Извлекают в стерильных условиях мышиные селезенки, очищают их от соединительной ткани, помещают в чашку Петри диаметром 12 см с охлажденным до 0°С раствором Хенкса (5 мл на селезенку) и измельчают на мельчайшие кусочки при помощи двух пинцетов. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно отбирают шприцем (игла № 18). Через 5—10 мин крупные скопления клеток оседают, находящиеся в надосадочной фракции спленоциты центрифугируют 5 минут при 150 g, дважды отмывают охлажденным до 0°С раствором Хенкса. Из каждой селезенки получают 5—10х10⁷клеток. Жизнеспособность клеток определяют при помощи окраски трипановым синим (см. раздел "Образование антител культурами клеток"), она составляет 90— 95%.

Идентификация макрофагов в суспензии клеток

Макрофаги идентифицируют по способности воспринимать нейтральный красный или коллоидный уголь (тушь). Окрашивание нейтральным красным см. в разделе 3.19.2. Для определения поглощения коллоидного угля 10⁷ спленоцитов культивируют в силиконизированной чашке Петри в присутствии 0,1 мл раствора туши; условия культивирования аналогичны условиям макрофагов (см. раздел "Культивирование макрофагов и моноцитов. Методика."). После 15—20-часового культивирования клетки осторожно отделяют от дна чашки Петри и микроскопируют, выявляя фагоцитирующие клетки. Число фагоцитирующих клеток должно составлять 1000—2000.

Отделение макрофагов путем адгезии в чашках Петри

Полученные спленоциты суспендируют в среде Игла-МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров. Концентрация клеток должна составлять около 10⁷ клеток/мл. Суспензию разливают порциями по 3,5 мл в стеклянные чашки Петри диаметром 6 см и инкубируют их в течение 1 часа на обогреваемом столике (37 °С). Затем чашки резко качают в горизонтальном направлении, чтобы взболтать неадгезировавшие спленоциты, которые отсасывают шприцем и переносят в другую чашку Петри. Проводят еще одну инкубацию в течение 30 минут, неадгезировавшие клетки переносят в новую чашку ,Петри и еще раз дают им возможность прикрепиться к стеклу. Клетки, оставшиеся в жидкой фазе, осаждают центрифугированием, отмывают 1 раз раствором Хенкса и используют для дальнейших исследований.

Отделение макрофагов при помощи порошка карбонила железа

Спленоциты суспендируют в растворе Хенкса с добавлением 5% сыворотки эмбрионов коров. Концентрация клеток должна составлять около 2х10⁷ кл/мл. Эту суспензию разливают порциями по 10 мл в 50-миллилитровые эрленмейеровские колбы и добавляют по 400 мг порошка карбонила железа, закрывают колбы силиконовыми пробками. Вносимый карбонил железа предварительно стерилизуют УФ-излучением. Колбы помещают на качалку на 30 мин при 37°С (водяная баня или термостат), число качаний составляет 80—100 в 1 минуты. По окончании инкубации удаляют из суспензии железосодержащий порошок, а также макрофаги, захватившие частицы порошка. Для этого ко дну колбы прикладывают сильный магнит, надосадочную фракцию декантируют. Процесс повторяют до тех пор, пока не останется следов железосодержащего порошка в суспензии клеток. После однократной отмывки раствором Хенкса клетки можно использовать для дальнейших исследований.

Отделение макрофагов на сефадексе g-10

В качестве колонки для G-10 используют 30-миллилитровый селиконизированный стеклянный шприц с иглой № 14. В колонку вносят около 3 мл нейлоновой ваты, сверху помещают набухший автоклавированный сефадекс G-10. После вытекания остатков жидкости колонку промывают 100 мл изотонического буфера. Наносят на колонку 2—4 мл суспензии спленоцитов и дают ей войти в слой геля. Не собирающиеся на сефадексе спленоциты вымывают 25—30 мл изотонического буфера. Вытекающие фракции собирают в центрифужную пробирку, стоящую во льду. Спленоциты отмывают однократно раствором Хенкса, после чего они готовы для дальнейшей работы.

Отделение макрофагов при помощи антимакрофагальной сыворотки

Готовят суспензию спленоцитов в растворе Хенкса с концентрацией 2х10⁷ клеток/мл. Разливают ее по 10 мл в 50-миллилитровые эрленмейеровские силиконизированные колбы. Вносят в суспензию 1 мл АМС и 1 мл комплемента, инкубируют 2 часа при 37°С, постоянно встряхивая. Частота качаний 20—30 в 1 минуты. Осаждают клетки центрифугированием и трижды отмывают раствором Хенкса.