Главная

• Аллергия
• Клиническая иммунология
• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Равновесный диализ

Материалы и оборудование
Постановка опыта
Определение концентрации гаптена
Оценка метода

Равновесный диализ представляет собой классический метод определения параметров связывания низкомолекулярных лигандов с биополимерами, в том числе аффинности антител. Раствор антитела известной концентрации приводится в соприкосновение с раствором гаптена через полупроницаемую мембрану. Оба компонента растворены в одинаковом буфере для того, чтобы исключить разницу рН и ионной силы. Молекулы антител не приходят через мембрану, молекулы гаптена диффундируют через нее в раствор антител и частично связываются с ними. Состояние равновесия достигается, когда концентрация свободного гаптена становится одинаковой по обе стороны мембраны. Время диффузии зависит от проницаемости мембраны, природы гаптена и температуры. Измерив концентрацию свободного гаптена по обе стороны мембраны, можно определить количество гаптена, связанного с антителами. В процессе измерения следует учитывать мембранные эффекты, например, адсорбцию.

Поскольку молекулы антител несут определенный заряд, следует учитывать эффект Доннана в том случае, если гаптен тоже заряжен. Обычно для проведения диализа используют целлофановые пакеты или специально сконструированные диализные ячейки. Данному вопросу посвящен исчерпывающий обзор Eisen [Eisen H. N. Determination of antibody affinity for hapten by means of fluorescence quenching. — ibid. 115].

Материалы и оборудование

Сосуд для диализа,
раствор антитела,
раствор гаптена,
спектрофотометр или радиометр,
термостат.
В качестве растворителя чаще всего используют 0,01 М фосфатный буфер рН 7,4 или 0,1 М трис-НСl-буфер, рН 7,4. Величина рН и ионная сила могут варьировать в зависимости от целей эксперимента. Для уменьшения эффекта Доннана целесообразно использовать забуференный 0,15 М раствор NaCl. Выбор концентрации гаптена и антител зависит от ожидаемой величины константы равновесия.

Примерная концентрация антител для равновесного диализа при различных константах ассоциации

Постановка опыта

В ячейку для диализа (в данном случае диализный мешок) вносят 2 мл раствора антител. Завязанный с обоих концов мешок помещают в подходящий сосуд, например, закрывающуюся стеклянную пробирку 10х75 мм. Затем в жидкость, против которой ведут диализ, вносят 2 мл раствора гаптена.

Схема диализного устройства

кружками обозначены антитела, точками — гаптен

Для эксперимента используют несколько пробирок с различными исходными концентрациями гаптена, это позволяет получить более точные значения константы ассоциации. Кроме того, необходимо проводить контрольный диализ, для чего диализные мешки, внутри которых находится только буфер, помещают в растворы гаптена с различными по меньшей мере двумя концентрациями. Это необходимо для определения момента наступления равновесия. Можно также определить количество гаптена, неспецифически связанного с материалом диализного мешка. Пробирки с образцами устанавливают в штатив и инкубируют в термостате при постоянном покачивании или вращении. Время наступления равновесия может колебаться от 4 при 30 °С до 20—40 ч при более низкой температуре.

Определение концентрации гаптена

Концентрацию окрашенных гаптенов можно определять с помощью спектрофотометрии. Для измерения концентраций гаптенов, меченных радиоактивными изотопами, применяют счетчики ионизирующего излучения. Сначала определяют в отсутствие антител количество неспецифически связанного гаптена. Это можно сделать, измерив количество гаптена в диализном мешке и в жидкости, омывающей мешок, после наступления равновесия. Количество неспецифически связанного гаптена равно разности между первоначально внесенным количеством гаптена и суммарным количеством гаптена по обе стороны диализной мембраны. В таблице приведены примеры подобных определений для пяти исходных концентраций. Условия опыта следующие: в диализной жидкости — 2 мл ¹⁴С-2,4-динитроанилина, внутри диализного мешка 2 мл буферного раствора (0,1 М трис-HCl, рН 7,4; 0,1 М КCl). Продолжительность диализа составляет 5 часов при 30 °С в условиях медленного вращения; специфическая активность гаптена — 520 имп/нМоль. Измерения проводили с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика.

Определение количества неспецифически связанного гаптена

Данные, приведенные в таблице, представляют собой среднее значение данных, полученных в двух одинаковых измерительных стаканах. Учет неспецифически связанного гаптена облегчает расчет количества гаптена, связанного антителами.

Схематическое изображение равновесного диализа (после достижения состояния равновесия)

светлыми кружками обозначены антитела, темными — антитела + гаптен, точками — гаптен

Определение количества гаптена, связанного антителами. Результаты измерений

Условия опыта: диализная жидкость вне мешка—2 мл ¹⁴С-2,4-диннтроаиилииа в различных концентрациях. В диализном мешке 2 мл раствора антител (240 мкг/мл, очищенных антител, специфичных к динитрофенильной детерминанте). Буфер: 0,01 М трис-HCl, рН 7,5, 0,1 М КС1; продолжительность диализа 5 ч при медленном вращении и температуре 30 °С.

Данные в колонке III таблице 4 откорригированы на 15% в соответствии с данными колонки II таблицы 1. В колонке IV таблицы 2 приводятся данные о количестве связанного антителами гаптена с учетом исходных концентраций и разностей значений в колонках II и III (молярное соотношение гаптена, связанного с AT, приведено в колонке V).

В таблице приведены данные измерений совместно с данными расчета. Поправка за неспецифическое связывание антигена была принята равной в среднем 15%.

Оценка метода

Методы определения гаптенов могут варьировать в зависимости от природы гаптена и ожидаемой константы ассоциации. При использовании окрашенных гаптенов в значениях констант ассоциации от 10³ до 10⁵ М^-1 измерить концентрацию гаптена по оптимальной плотности. При исследовании систем с Ка выше 10⁶ М^-1 нужны более чувствительные методы, целесообразно использовать гаптены, меченные ¹⁴С. Радиоактивные гаптены весьма эффективны для определения Ка в области 10⁶—10⁷ Е^-1. Для определения констант ассоциации в области 10⁷—10⁸ М^-1 необходимы гаптены, меченные тритием. При еще более высоких константах ассоциации гаптен находится в основном в связанном состоянии и его прямое определение затруднено. Следует также учитывать, что при низких Ка необходимые для проведения измерений количества гаптена должны быть достаточно высокими, чтобы определить разницу между свободным и общим гаптеном внутри диализного мешка. Вследствие этого точное измерение концентрации АТ (антитело) затруднено. При проведении равновесного диализа не обязательно использовать высокоочищенные антитела.