Главная

Ускорение синтеза белка

Стимуляция с помощью митогена приводит к увеличению скорости синтеза белка, измеряемой обычно по включению радиоактивно меченных аминокислот во фракцию, нерастворимую в 5%-ной трихлоруксусной кислоте. В случае Кон А и ФГА это становится заметным уже через 2—3 ч.

Сравнение скорости включения аминокислот (непрерывная линия) и процентного содержания рибосом, активно участвующих в синтезе белка (прерывистая линия) в лимфоцитах периферической крови человека, стимулированных с помощью ФГА.

На левой оси ординат отложено включение метки в лейцин (имп/мин/106 клеток X 10-2) при 30-минутной импульсной метке, заканчивающейся в момент времени, указанный на оси абсцисс. На правой оси ординат отложено процентное содержание активных рибосом. ФГА добавляли в момент времени О в концентрации 2 мкг/мл.

В дальнейшем скорость синтеза постепенно увеличивается, достигая максимального уровня (превышающего в 10—40 раз начальный) за 48—72 ч,— время, совпадающее с периодом наиболее быстрого клеточного деления. Увеличение скорости синтеза белка в первые 3 ч приписывается возрасшей активности факторов инициации, что может объяснить наблюдаемое быстрое включение предсуществующих матричных РНК (мРНК) в полирибосомы. На эту раннюю стадию синтеза белка не действуют ингибиторы синтеза или процессинга мРНК. Кроме того, при этом не происходит увеличения количества РНК в расчете на одну клетку.

В промежутке между 3 и 20 ч доля «активных» рибосом (имеются в виду рибосомы, содержащие новосинтезирующие пептиды и не диссоциирующие на субчастицы в буферных растворах с высоким содержанием соли) возрастает с начального уровня 25% до порядка 70—80%. Доля рибосом, входящих в составе полирибосом, также увеличивается от 25 до примерно 70%. Кроме того, в результате преобладания синтеза РНК над ее распадом начинает увеличиваться количество РНК в расчете на одну клетку. Скорость ассоциации 35S-MeT-TPHK с полисомами повышается, однако увеличения содержания белка в расчете на одну рибосому или скорости элонгации синтеза белка не наблюдается.

Через 48 ч интенсивность синтеза белка достигает максимального уровня, при этом количество РНК в клетке возрастает в 2 раза по сравнению с количеством, характерным для покоящихся клеток, а скорость трансляции и содержание белка в расчете на одну рибосому — в 10 раз. Увеличение количества полисом и активных рибосом, наблюдавшееся к 24-му часу, сохраняется. Имеются данные, что при переходе клеток обратно в состояние покоя эти характерные для бласттрансформации изменения прекращаются, возвращаясь к первоначальному уровню быстрее, чем синтез ДНК. Однако следует оговориться, что фаза затухания ответа изучена не так хорошо, как ранние стадии активации.

Необходим ли синтез белка для синтеза ДНК? Нетрудно показать, что клетки не синтезируют ДНК и не делятся, если стимуляция проходила в присутствии ингибиторов синтеза белка. Однако было бы рискованным утверждать, что если ингибитор какого-либо клеточного процесса предотвращает также и синтез ДНК, то эти процессы взаимозависимы. К тому же в отсутствие синтеза белка клетки теряют жизнеспособность и погибают. Более того, ингибитор может изменить до неузнаваемости течение каких-либо других процессов, которые как раз и необходимы для синтеза ДНК. Тем не менее в совокупности имеющиеся данные свидетельстуют в пользу важной роли раннего синтеза белка для активации. Если в культуру клеток добавить ингибитор синтеза белка пуромицин за 1,5 ч до добавления Кон А и удалить через 2,5 ч, то синтез ДНК, возникающий через 48 ч после стимуляции Кон А, подавляется. Для такого эффекта белковый синтез должен быть ингибирован по крайней мере на 75%. Если Кон А уже присутствовал за 6 ч до того, как был добавлен ингибитор, то синтез ДНК подавляться не будет. Это говорит о том, что белки, существенные для синтеза ДНК, образуются в первый час и не позже шестого часа. Возражения, выдвинутые выше, частично снимаются данными о том, что циклогексимид (еще один ингибитор синтеза белка с другим механизмом действия) вызывает такой же эффект, как и пуромицин, и что влияние обоих этих реагенов на синтез как ДНК, так и белка почти полностью прекращается после их удаления. Существуют данные, противоречащие этому выводу. Так, было показано, что клетка может синтезировать ДНК через 48 ч после добавления Кон А даже несмотря на то, что ингибитор синтеза белка (анизомицин) присутствует в культуре в первые 24 ч, однако достигаемую при этом степень ингибирования синтеза белка не определяли.

Количество различных белков, синтезируемых в активированных лимфоцитах, огромно. Поскольку определенные белки предпочтительно синтезируются в определенное время и поскольку одни белки могут иметь более важное значение для реализации активационной программы, чем другие, измерение общего уровня синтеза белка — это лишь первый шаг в выяснении роли новосинтезированных белков в активации. Не исключено, что синтез некоторых белков претерпевает значительные изменения в первые часы активации, задолго до появления изменений в скорости синтеза большинства остальных белков. Это предположение возникло в результате опытов, в которых методом ДСН-ПАГЭ (электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 2% додецилсульфата натрия) исследовали белки, меченные с помощью радиоактивных предшественников и отбираемые через различные промежутки времени после стимуляции лимфоцитов воздействием ФГА или Кон А. Юдей и Паркер описали гетерогенный по заряду белок с мол. массой 28 кДа, который они обнаружили в мембранах выделенных Т-клеток человека, обработанных Кон А. Этот белок, по-видимому, расположен на наружной поверхности мембраны клетки, поскольку он оказался чувствительным к действию протеолитических ферментов или нейраминидазы. Увеличение синтеза этого белка отмечается уже ко второму часу, что совпадает с самыми ранними данными об изменениях суммарного синтеза белка. Бото и Хэмфрейс сообщили, что белок с мол. массой 55 кДа синтезировался с повышенной скоростью в течение как первого, так и второго дня с момента начала стимуляции воздействием Кон А или ФГА, белки с мол. массами 30 и 35 к Да — только во второй день, белок с мол. массой 120 кДа — только начиная с третьего дня, а белок с мол. массой 125 кДа, обнаруживаемый в покоящихся клетках, исчезал в первый день после стимуляции и вновь появлялся на четвертый и пятый дни. Хотя наборы белков, наблюдаемые при стимуляции с помощью Кон А и ФГА, во многом похожи, между ними существуют определенные различия, объясняющиеся, возможно, тем, что популяции Т-клеток, стимулируемые этими митогенами, не идентичны.

Через четыре часа после добавления Кон А наибольшая концентрация новосинтезированных белков оказывается в плазматической мембране, несколько меньшая — в цитоплазме и самая меньшая — в ядре и митохондриях. Сократительный белок актин выделяется среди цитоплазматических белков тем, что скорость его синтеза увеличивается в первые 12 ч. Через 12 ч наблюдается значительное увеличение размера ядра (бласттранс- формация), зависимое от синтеза новых белков ядерного матрикса. Определенные ядерные негистоновые белки регулируют активность ДНК-полимеразы: синтез белков этой категории (особенно это касается негистонового белка с мол. массой 40 кДа) увеличивается через 12 ч после добавления ФГА к лимфоцитам человека или Кон А — к лимфоцитам кролика. Наблюдается увеличенный синтез гистонов, так же как и ядерных негистоновых белков в Т-клетках. Стимуляция В-клеток кролика с помощью антител к иммуноглобулинам вызывает аналогичные изменения.

В следующем десятилетии мы несомненно станем свидетелями того, насколько больше внимания будет уделяться кинетике синтеза определенных белков на ранних этапах стимуляции клеток митогенами, особенно в В-клетках, в случае которых вопрос на сегодняшний день изучен недостаточно. Выяснение природы и функции этих интересных белков, идентифицируемых только как полосы в геле, будет трудной, но благодарной задачей.