| |
Главная |
Получение антисывороток от различных животныхЭкспериментальные животные Для большинства иммунологических и серологических методов исследования необходимо иметь соответствующие антисыворотки. Антисыворотки к так называемым стандартным антигенам, например человеческому IgG, имеются в продаже, к нестандартным антигенам антисыворотки приходится получать в лаборатории. Основные требования к таким сывороткам — специфичность и достаточное содержание антител (AT). Иммунологическая специфичность не абсолютна, она тесно связана со структурой антигена (АГ). Белки ввиду относительного многообразия составляющих их аминокислот и практически неограниченной возможности их комбинирования представляют собой природные соединения с исключительно разнообразным строением. С точки зрения иммунологии это означает, что антитела к определенному белковому антигену могут реагировать только с ним и родственными по структуре белками. Под последними следует понимать гомологичные протеины родственных биологических видов, а также белки, образующие одно «семейство», например гонадотропины. Все они имеют общую α-цепь, в то время как ß-цепи содержат полипептидные последовательности, индивидуальные для каждого гормона. Способность к перекрестным реакциям антител с антигенными детерминантами структурно близких белков находит практическое применение. Допустим, требуется получить антитела к какому-либо гормону гипофиза человека; получение антисыворотки невозможно ввиду отсутствия достаточного количества человеческих гормонов. В то же время получение этих гормонов из гипофиза свиней или быков вполне осуществимо. При использовании бычьего гормона для получения антител существует высокая вероятность того, что индуцированные антитела будут давать выраженную перекрестную реакцию с аналогичным гормоном человека и, следовательно, окажутся пригодными для постановки специфических проб. Не следует, конечно, ожидать, что антитела к какому-либо определенному белку будут реагировать со структурно неродственным белком; избирательность иммунологических реакций обусловлена их высокой специфичностью. Углеводы, липиды и особенно нуклеиновые кислоты в отличие от белков состоят из сравнительно малого числа структурных элементов, возможность комбинирования которых ограничена по сравнению с белками. Можно с большой степенью вероятности предположить, что вещества такого типа, будучи выделены из разных источников, будут обладать выраженным структурным сходством. С иммунологической точки зрения это означает, что антитела к углеводам, липидам и нуклеиновым кислотам в отличие от АТ (антитело) к белкам будут активно вступать в перекрестные реакции с филогенетически неродственными антигенами. Подобные взаимодействия отличаются низкой специфичностью, ограничивающей их использование в иммунологических исследованиях. Это порождает необходимость разработки дополнительных тест-систем. Для практической иммунологии можно сделать следующее заключение: антитела к белкам обладают высокой специфичностью, они удобны для определения антигенов; антитела к липидам, углеводам и нуклеиновым кислотам малоспецифичны, что приводит к не всегда желательным перекрестным реакциям. Схематическое изображение хода различных процессов при первичном и вторичном иммунном ответе кролика на введение белковых антигенов
Для получения сывороток с высоким титром антител необходимо учитывать и соответствующим образом использовать механизмы регуляции гуморального иммунного ответа. Например, введение больших доз антигена может индуцировать образование супрессорных клеток, подавляющих выработку антител, и, наоборот, использование феномена «иммунологической памяти» может существенно облегчить получение сыворотки с высоким титром антител. Введение антигена приводит не только к образованию антител, но и к появлению «клеток памяти» — лимфоцитов со специфической реактивностью в отношении вызвавшего иммунную реакцию антигена. «Клетки памяти» распространяются по всему организму и оседают в периферических органах лимфатической системы. Повторное введение антигена приводит к заметному увеличению выработки антител по сравнению с первичным иммунным ответом; антитела вторичного иммунного ответа циркулируют в крови более продолжительное время. Поскольку образование «клеток памяти» — процесс довольно длительный, не следует выбирать слишком маленький промежуток времени между первичным и повторным введением антигена. Показано, что для мышей оптимальный промежуток времени после первого введения антигена составляет 90 дней. Скорость возникновения иммунологической памяти зависит от природы антигена, принято считать что у кроликов и морских свинок она возникает не ранее чем через 6 нед, у крыс и мышей не ранее чем через 4 недели, у низших позвоночных не ранее чем через 3 месяца. Гуморальный иммунный ответ можно усилить при помощи адъювантов, этот способ известен давно. Наиболее распространены полный адъювант Фрейнда и гидроокись алюминия. В последнее время в качестве адъювантов применяли мурамилпептиды. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) выпускается в виде коммерческого препарата, в его состав входит минеральное масло, эмульгатор и убитые микобактерии туберкулеза. Полный адъювант Фрейнда смешивают с водным раствором антигена до получения стабильной водно-масляной эмульсии. На процесс эмульгирования следует обращать особое внимание, так как адъювантный эффект наиболее выражен у стабильных эмульсий. Гидроокись алюминия не обладает столь выраженными стимулирующими свойствами, как полный адъювант Фрейнда, но по сравнению с последним имеет то преимущество, что при многократном введении не вызывает изменений в периферических лимфатических органах. Вопрос выбора адъюванта решается в каждом случае индивидуально. По-видимому, идеальные антисыворотки можно получать, используя гибридомную технологию, разработанную в лаборатории Мильстайна (Кембридж). Получают клеточные гибриды из лимфоцитов иммунизированного животного и культивируемых in vitro миеломных клеток; из полученных гибридов отбирают клоны клеток, синтезирующих определенные антитела. Моноклональные антитела обладают абсолютно одинаковой специфичностью в отличие от поликлональных антител, содержащихся в обычных сыворотках, имеющих различную специфичность и дающих перекрестные реакции. |