Главная

Иммуноферментный анализ. Оценка метода

Область применения и чувствительность ИФА соответствуют радиоиммунологическим методам исследования. Но иммуноферментный анализ по сравнению с радиоиммунологический анализ обладает целым рядом преимуществ: не используются радиоактивные изотопы, стабильность конъюгатов позволяет хранить их в течение длительного времени, измерение оптической плотности проводят в оптическом диапазоне, результаты ИФА можно оценивать полуколичественно без применения аппаратуры (визуально). ИФА очень легко поддается автоматизации, может быть использован, наконец, в иммунопатологических исследованиях и реакциях иммунопреципитации.

Для ИФА используются более дешевые материалы и приборы, чем для РИА. И отчасти в связи с этим область применения ИФА очень широка.

Применение ИФА в медико-биологических исследованиях

Объект исследования	Примеры
Микроорганизмы (AT или АГ)	Вирусы Коксаки В, гепатита А и В, простого герпеса, инфлюэнцы, краснухи; бруцеллы, холерный вибрион, кишечная палочка, сальмонеллы, трепонемы; амебы, плазмодии, токсоплазмы, трипаносомы, столбнячная палочка
Гельминты	Филярии, шистосомы, трихинеллы
Белки сыворотки	α-Фетопротеин, канцероэмбриональный антиген, фактор VIII, ферритин, фибронектин, гаптогло» бин, IgA, S-IgA, IgE, IgG, IgM
Гормоны	Кортизон, человеческий хорионический гонадотропин, человеческий плацентарный лактоген, инсулин, эстрогены, прогестерон, тестостерон, ренин, соматостатин, тироксин, тиреотропин
Медикаменты	Хинидин, кодеин, дигоксин, гентамицина сульфат, метотрексат, морфнн, препараты группы пенициллина, фенобарбитал, новокаинамид, пропанолол (Propanolol) теофиллин и др.
Разное	Аденозин, ДНФ-IgG, С-реактивный белок

Так же как в РИА, специфичность и чувствительность ИФА даже при оптимальных условиях зависят от качества сыворотки. Рекомендуется использовать только высокоавидные и высокоспецифические антитела. Антитела достаточной для ИФА степени чистоты легко могут быть получены путем иммуноадсорбции, во время которой удаляются неспецифические и могущие быть помехой антителам. Кроме того, необходимо исключить возможные перекрестные реакции с другими антигенами. Специфичность реакции может быть уменьшена неспецифической адсорбцией антител или энзиммеченых компонентов реакции на твердой фазе. Самыми сложными и важными этапами ИФА являются получение и очистка ферментных конъюгатов. Для присоединения ферментов к белкам чаще всего используют глутаральдегидный метод. Поскольку наличие неконъюгированных белков снижает специфичность реакции, необходимо проводить очистку конъюгатов гель-фильтрацией или любым другим методом. При получении конъюгатов пероксидаза — иммуноглобулин молярное соотношение фермент/ИГ рассчитывается по соотношению экстинкции при длине волны 405 и 208 нм. Иммунологическая характеристика фермент-белковых конъюгатов исследуется при помощи метода иммунодиффузии. Для разработки системы ИФА лучше использовать общедоступные антигенонезависимые конъюгаты, такие как антитиповые антитела к иммуноглобулин или протеин А, конъюгированные с ферментом. Такие конъюгаты дают возможность распространять иммуноферментную диагностику на ряд других антигенов. В качестве маркеров для ИФА чаще всего используют пероксидазу, щелочную фосфатазу или глюкозооксидазу.

Ферменты-маркеры, наиболее часто используемые в ИФА

Фермент	Индикатор реакции	Реагент, останавливающий реакцию	Длина волны для оценки реакции
Пероксидаза	Н₂О₂ орто-дианизидин (или ортофенилендиамин); 2,2-азино-диэтилбензтиазолинсульфат (АБТС)	HCl5 М Na₂S0₄ 2 М NaOH 1 М	535 405 405
Щелочная фосфатаза	Пара-нитрофенилфосфат	NaOH 1 М	402
Глюкозооксидаза	Н2О2 (пероксидаза) о-дианизиднн или АБТС	H2SO4 0,5 М	405
D-β-галактозидаза	Пара-нитрофенил-β-D- галактозид		366

Коммерческие препараты пероксидазы хрена требуют дополнительной очистки дo RZ более 2,5. RZ (нем. Reinheit-Zahl— буквально число чистоты) определяется как соотношение экстинкции на длинах волн 405 и 280 нм. Высокоочищенные препараты пероксидазы имеют RZ 3,0 и выше. Воспроизводимость результатов ИФА зависит от многих факторов, в том числе от условий измерения, оптимизации фермент-субстратного взаимодействия, толщины слоя и поглощающих свойств анализируемых растворов. Негомогенность материала планшетов (неконтролируемый фактор) отрицательно влияет на воспроизводимость. Отмывки между отдельными этапами анализа моющими средствами, добавлениембычьий сывороточный альбумини др. также влияют на нее. Коэффициент вариации ИФА составляет менее 10%. В качестве твердой фазы для ИФА применяют такие материалы, как полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, полиакриламид, агарозу, целлюлозу и др. Твердая фаза может быть использована в виде пробирок, планшетов для микротитрования, бусин, шариков, гранул, пленок и т. д. Необходимым прибором для ИФА является спектрофотометр. При анализе больших серий материала желательно использовать автоматические пипетки и автоматические ридеры (приборы для автоматического считывания результатов ИФА, от англ. read — читать). В будущем ИФА, вероятно, сможет полностью вытеснить РИА, если удастся преодолеть некоторые сложности: снизить затраты ручного труда путем автоматизации, исключить ковалентное или адсорбционное связывание антигена или антитела с твердой фазой, а также освоить приготовление конъюгатов ферментов с небольшими молекулами.