| |
Главная |
Реакция связывания комплемента тромбоцитами. Постановка опытаСенсибилизация эритроцитов барана. ЭБ 3—4 раза отмывают 0,15 М NaCl, последнюю отмывку делают барбиталовым буфером. Из осадка готовят суспензию ЭБ в том же буфере (4х106 клеток/мкл). Для сенсибилизации к суспензии эритроцитов медленно добавляют равный объем гемолизина, титр которого подбирают в предварительном опыте. Смесь инкубируют 30 минут на водяной бане при 37°С, многократно ее перемешивая, затем охлаждают до 4°С. Сенсибилизированные эритроциты готовят в день опыта. Определение титра гемолизина. Готовят разведения гемолитической сыворотки от 1:400 до 1/12 800 с двукратным шагом, по 2 мл каждого разведения. К 2 мл каждого разведения гемолизина приливают равный объем суспензии ЭБ (4х106 клеток/мкл), происходит сенсибилизация. Реакцию ставят в камере для микротитрования под слоем вазелинового масла. Комплемент добавляют в избытке (сыворотку АВ в разведении 1 : 10 или сыворотку морской свинки в разведении 1 : 20). Наибольшее разведение гемолизина, при котором еще наблюдается полный гемолиз, содержит 1 гемолитическую единицу. Для постановки основного опыта используют 4 гемолитические единицы. Пример: если полный гемолиз наблюдается при разведении гемолизина 1:3200, то для опыта используют разведение 1 :800. При повседневном проведении реакции связывания комплемента с одними и теми же реагентами титр гемолизина определяют 1 раз в неделю. Если титр комплемента известен, можно провести перекрестное титрование гемолизина. В приведенную таблице схему титрования вводят разведения комплемента, указанные ниже. Схема титрования гемолизина
Определение титра комплемента. Все разведения комплемента готовят на барбиталовом буфере. Вспомогательное титрование и основной опыт проводят в одинаковых условиях. Титр комплемента определяют каждый раз в день постановки опыта. Чтобы повысить чувствительность реакции связывания комплемента, приготовляют следующие разведения комплемента: 1: б, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28, 32. Камеру для титрования заполняют 6—8 мл вазелинового масла. Все пробы дублируют. Схема титрования комплемента
Результаты реакции легче учитывать после осаждения эритроцитов центрифугированием. Степень гемолиза оценивают визуально по окраске надосадочной фракции и величине осадка эритроцитов в баллах от 0 до 4. Оценка степени гемолиза
Наибольшее разведение комплемента, которое еще дает полный гемолиз, принимают за 1 гемолитическую единицу комплемента. В основном опыте используют 2 единицы комплемента. Если, например, комплемент в разведении 1 : 24 вызывает полный гемолиз ЭБ, для основного опыта используют разведение 1 :12. При использовании одной гемолитической единицы чувствительность реакции связывания комплемента возрастает, но возрастает также влияние помех. Международная стандартизированная методика реакций связывания комплемента для определения HLA-антигенов на тромбоцитах. Заливают камеры для титрования 6—8 мл вазелинового масла. В лунки вносят по 2 мкл следующих реагентов: Антитела (сыворотка в
различных разведениях, элюаты). Для каждой серии суспензии тромбоцитов и для каждой сыворотки ставят следующие контроли: Контроль антигена: Контроль антител: Если нет подходящей центрифуги, микропланшеты оставляют на 30 минут при комнатной температуре или 4°С для полного осаждения негемолизированных эритроцитов. Учет реакции проводят, как и при титровании комплемента, в баллах. В крупных лабораториях проводят количественную реакцию связывания комплемента на автоматическом микроскопе-денситометре. Причинами ложноположительных или ложноотрицательных результатов могут быть: — загрязнение центрифужных пробирок, микропланшетов, пипеток, шприцев и т.
д.; |