| |
Главная |
Реакция связывания комплемента. Постановка опытаМатериалы и оборудование Реагенты Вероналовый буфер: Раствор Витте для консервации комплемента: Раствор Олсвера: Эритроциты: отбирают в стерильных условиях кровь в раствор в соотношении 1+2. Разливают смесь по стерильным пробиркам. Перед употреблением выдерживают смесь 2 дня. Сохранность — 6—8 нед. Гемолизин: используют амбоцепторы государственного института иммунопрепаратов в Берлине. Амбоцепторы не должны агглютинировать эритроциты. Разведения свыше 1:1200 не используются. Комплемент: используют свежие лиофилизированные или консервированные сыворотки (валовую сыворотку, взятую от возможно большего числа животных). Кровь для сывороток получают пункцией сердца или вскрытием сонной артерии с целью предотвращения бактериального загрязнения. Поскольку не всегда имеются коммерческие препараты комплемента, можно использовать комплемент, консервированный раствором Витте. Активность таких препаратов сохраняется при 5°С в течение б месяцев. В любом случае препарат комплемента не должен быть загрязнен специфическими антителами, сыворотки, содержащие менее 50 ЕД активности в мл, для работы не пригодны. Антигены: для диагностики рекомендуется использовать официально стандартизованные препараты, но и в этом случае желательно точно установить, кривые изофиксации. Оснащение: Фотометр (например, Carl Ziss, Иена); микропланшеты для титрования (U-образная форма лунок), микрошприцы на 25 мкл, устройство для отмывки планшет, автоматизированная микросистема для титрования (для реакции связывания комплемента в 0,2 мл), стеклянные пробирки и штативы, термостат на 37°С, водяная баня для инактивации комплемента (56°С), холодильник, центрифугу. Гемолитическая системаПолучение суспензии эритроцитов баранаЗаконсервированные эритроциты барана трижды отмывают буфером. Получают 3% суспензию. 0,5 мл этой суспензии смешивают с 4,5 мл дистиллированной воды, определяют экстинк-цию при длине волны 540 нм в односантиметровом кювете. Получают 1,5% суспензию:
V — наличный объем, Е — измеренная экстииция Проверка гемолизинов (амбоцептора) 1 часть = 25 мкл (микропроба) или 200 мкл (макро = РСК) Определение титра агглютинации: (исключительно при холодовом связывании):
Определение необходимого разведения гемолизина:
Определение авидности:
Степень авидности должна быть по возможности не выше 0,9 и не ниже 0,7. Гемолизин и эритроциты в день эксперимента смешивают в равных объемах и сохраняют при 5°С, перед использованием прогревают в течение 30 минут при 37°С на водяной бане.
Приготовление антигена Часто в практике научных исследований приходится пользоваться нестандартизованными антигенами. Эти антигены следует как можно тщательнее очистить от сопутствующих примесей, способных привести к ложноположительным результатам. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить дифференциацию между комплементингибирующим и специфическим антигенным действием. Для этой цели предназначен контроль 2. Для постановки контроля 1 необходимы тщательно охарактеризованные реагенты (антигены, сыворотки и т. д.). Учитывая желательную точность результатов, оценки антигенов проводят макрометодом. Во всех случаях необходимо не только использовать оптимальные дозы АГ, но также контролировать его специфичность. Контроль 1 (предварительный опыт)
Для этого эксперимента используют титрование по схеме так называемой шахматной доски или блок-титрование, в котором анализируют ряд разведений АГ относительно ряда разведений антисыворотки. Степень торможения гемолиза оценивается ио четырехбалльной системе. В качестве единицы АГ берут такое его максимальное разведение, которое способно связывать 3—4 максимальных разведения сыворотки. Исследуемый и контрольный антигены, контрольная антисыворотка не должны давать торможения гемолиза. В основном опыте используют 2 единицы антигена. Контроль 2 (предварительный опыт) Определение комплементингибирующего действия (в пробирках)
К — контрольное значение гемолиза Необходимо проверять наличие неспецифического комплементингибирующего действия. В целом оно должно проявляться не более чем в 1—2 разведениях (при шаге = 1,25) по сравнению с контролем. Расчет фактора потребления комплемента (ФПК). ФПК определяют для каждого разведения АГ по формуле:
для разведения сыворотки 1:5—1:20 К=3,0 Для определения ФПК ставят контроль 2, так как значение ФПК необходимо знать для многих диагностически важных АГ в предварительной оценке комплемента. Это можно пояснить примером на рисунке. Определения фактора потребления комплемента
Определение антигенного действия:
Приготовление комплементаОпыт 1.Подбор ведут в присутствии 2 ЕД антигена
Опыт 2.
Сыворотки пациентов не должны обладать гемолитической активностью, их инактивируют в течение 30 минут на водяной бане (56 °С). Последующую инактивацию проводят при той же температуре в течение 10 минут. Особое значение имеет использование точно охарактеризованных контрольных иммунных сывороток. Если это человеческие сыворотки, то они должны иметь максимально высокий титр; смесь сывороток реконвалес-центов разливают по 1 мл в ампулы и хранят при —20°С или в лиофилизированном виде. Сыворотки, хранящиеся в шкафу глубокого охлаждения в открытых сосудах, могут повреждаться углекислым газом. Многократное замораживание и оттаивание также противопоказано. Определяют наличие ком-плементингибирующей активности, стараются использовать сыворотки наиболее подходящего вида животных. Основной опытОценка результатов реакции связывания комплемента сильно зависит от того, каким образом измеряют торможение гемолиза. Фотометрическое определение степени 50% гемолиза, несмотря на точность измерения, практически не всегда удобно. Гораздо чаще используют визуальную оценку для определения 100% или 50% гемолиза. Для более точной градации можно использовать четырехбалльную шкалу. За положительный результат принимают 3—4-кратное торможение (0—50% гемолиза). Опыт 1.
Опыт 2.
Варианты контроля Проводят позитивный и негативный контроль антигена и сыворотки.
МикрометодЛюбой вариант реакции связывания комплемента можно осуществлять в микромодификации. Необходимым в данном случае является подбор оптимальных реагентов. Используемые парциальные объемы могут составлять 25 или 50 мкл. Особое внимание следует обращать на чистоту планшетов и тщательное перемешивание комплементов. Водяную баню можно заменить термостатом. Оценивается не столько число лизированных эритроцитов, сколько количество нелизированного осадка эритроцитов. 100—50% лизис осадков рассматривается как отрицательный результат. Положительными результатами считаются следующие: + + + осадок эритроцитов почти неизмененной величины сослегка окрашенной
надосадочной фазой; Для предотвращения влияния субъективных оценок результаты должны оцениваться одним и тем же исследователем. Определенные проблемы создает соотнесение предварительного и основного опытов. Трудности возникают, когда титр гемолиза в обоих опытах различается, например 50 и 100%. Это связано с тем, что 100% гемолиз установить сложнее, чем 50%. Фотометрия, особенно с применением логарифмической бумаги, позволяет преодолеть эти сложности. Их легко избежать, если пользоваться одинаковой методикой в предварительном и основном опытах. Многообразия единиц антигена и комплемента можно не опасаться, если исходить не из принципа чистоты компонентов, а из принципа оптимальной, т. е. относящейся к области эквивалентности, дозы. Определение титра 50% гемолиза
По ординате — степень гемолиза, |