| |
Главная |
Проведение исследованияМатериалы и оборудованиеДля работы необходимы: Предварительно определяют гематокрит при помощи гематокритной центрифуги ТН1 или ТН2, разводят исходную суспензию сывороткой морской свинки. Адсорбированную СЭБ и разведенную в соотношении 1 : 10 средой Игла сыворотку морской свинки используют в качестве источника комплемента. Необходима также анти-IgG сыворотка (проявляющая сыворотка, ПС). Прямой метод локального гемолизаПодготовка чашек Петри (посуды): на дно чашек Петри диаметром 8 см наносят слой агара в среде Игла с добавлением ДЭАЭ-декстрана, концентрация агара — 1,4%; добавляют ДЭАЭ-декстран до концентрации 1 мг/мл, подавляющий антикомплементарное действие агара. Агар сравнительно труднорастворим. Первоначально готовят двойную концентрацию взвеси агара (2,8%) в дистиллированной воде, растворяют ее автоклавированием в течение 10 мин при 120 °С. Одновременно готовят среду Игла с добавлением ДАЭ-декстрана, оба раствора смешивают, когда агар несколько охладится. Величина рН золя должна составлять 7,4. В каждую чашку Петри вносят 3—4 мл золя агара. После застывания чашки могут храниться в холодильнике в течение 1—2 недель. Основной слой можно формировать без добавления ДЭАЭ-декстрана. Перед использованием чашки инкубируют при 37 °С в течение 1,5 ч для удаления воды с поверхности агара. Получение лимфоидных клеток. Грубую клеточную суспензию из лимфоидных органов (селезенка, лимфатические узлы, тимус) можно получить тремя различными методами: размельчением органа в гомогенизаторе с притертым тефлоновым пестиком в среде Игла, протиранием через тонкое сито из дедерона или нержавеющей стали, измельчением пинцетом и ножницами. Последний метод наиболее щадящий (большая доля живых клеток), но обычно выход клеток невелик. При обработке больших количеств материала с целью получения максимального количества клеток экономнее использовать сито или гомогенизатор. Время между забоем животного и помещением суспензии клеток на водяную баню не должно превышать 15 минут. Обломки клеток и грубые агрегаты удаляют центрифугированием при Ig в течение нескольких минут или фильтрованием через тонкую марлю. Гомогенность суспензии улучшается при ее многократном пропускании через шприц с тонкой иглой (№ 20). Суспензию клеток костного мозга получают путем смыва длинных трубчатых костей мелких животных или путем пункции у человека. При определении АОК в периферической крови необходимо получить суспензию лимфоцитов, свободную от автогенных эритроцитов, в противном случае можно пропустить лизис тестерных эритроцитов. Полученную суспензию центрифугируют при 350 g и 4 °С, дважды отмывают в среде Игла и суспендируют в этой среде. Конечный объем взвеси зависит от концентрации клеток, которая определяется в предварительных опытах так, чтобы получать 200— 300 зон гемолиза на чашку. Клетки должны быть использованы в опыте не позднее чем через 1 час после приготовления суспензии. Если обстоятельства не позволяют уложиться в этот срок, то клетки лучше хранить в виде осадка. Число АОК остается в этом случае неизменным. Всю работу до момента смешивания с золем проводят при 0—4°С. Живые клетки подсчитывают на основании их резистентности к окрашиванию трипановым синим (мертвые клетки окрашиваются в голубой цвет). Приготовление верхнего слоя, постановка опыта: Расплавленную агарозу или агар (0,7% раствор в среде Игла, рН 7,4) с добавлением 1 мг/мл ДЭАЭ-дек-страна разливают в пробирки по 1 мл и выдерживают при 47— 49 °С в водяной бане. Затем добавляют 0,1 мл 10% суспензии ЭБ и выдерживают еще 10—15 мин при той же температуре, наконец вносят 0,1 мл охлажденной клеточной суспензии и тщательно перемешивают, избегая образования воздушных пузырей. Немедленно смесь переносят в заранее прогретую чашку Петри со сформированным нижним слоем и равномерно распределяют ее по поверхности. Во время застывания агарозы чашки помещают на горизонтальную подставку, чтобы верхний слой геля был повсюду одинаковой толщины. Подготовленные чашки инкубируют во влажной камере в течение 2 часов при 37 °С. Нельзя допускать высыхание поверхности, так как это может уменьшить размер зон гемолиза ввиду образующихся при высыхании гипертонических условий инкубационной среды. В заключение наслаивают 1,5 мл комплемента морской свинки в разведении 1 : 10, инкубируют 30 минут при 37 °С и производят подсчет зон гемолиза. В нашей лаборатории для этой цели с успехом применяли прибор Dokumator DL II (VEB Carl Zeiss, JENA). Подсчет можно проводить при помощи стереомикроскопа или специального устройства для подсчета колоний. Сомнительные зоны исследуют под микроскопом. В центре каждой зоны должна находиться лимфоидная клетка. После смывания комплемента средой Игла пластины геля можно фиксировать 0,25% раствором глютарового альдегида в 0,9% NaCl или парами формалина. В этом случае подсчет зон гемолиза можно проводить и позднее. Непрямой метод локального гемолизаСеквенциальный метод. После подсчета зон гемолиза, образовавшихся в прямом методе локального гемолиза, смывают комплемент 2— 3 мл среды Игла. Инкубируют чашки в течение 1 ч при 37 °С с разведенной антиглобулиновой сывороткой («проявляющей» ПС). Подбор оптимального разведения ПС имеет важное практическое значение для успешной постановки непрямого локального гемолиза. Высокие концентрации сыворотки маскируют «непрямые зоны», слишком низкие неэффективно «проявляют» их. Эффективность «проявления» следует контролировать для каждой серии антиглобулиновой сыворотки. Для работы лучше всего использовать селезеночные клетки мыши, иммунизированной за 8—12 дней 4х108 ЭБ. В каждой селезенке образуется приблизительно в 10 раз больше непрямых АОК, чем прямых. После удаления проявляющей сыворотки проводят повторную инкубацию с комплементом (30 мин); повторно подсчитывают зоны гемолиза. Разность числа зон гемолиза, определяемых прямым и непрямым методами, дает количество АОК, не продуцирующих IgM. Торможение локального гемолиза (IgM) 2-меркаптоэтанолом или КонА. По окончании первой инкубации слой агарозы инкубируют еще 1 час при 37 °С с 0,15 М 2-меркаптоэтанолом или раствором КонА (0,4 мг/мл в 0,9% NaCl). Агарозу троекратно отмывают с интервалом в 10 минут раствором NaCl при 20 °С. Непрямые зоны гемолиза проявляют, как было описано выше, при помощи ПрС и комплемента. Наоборот, 2-меркаптоэтанол и КонА блокируют образование прямых зон гемолиза (IgM) и практически не влияют на формирование IgG-зависимых зон гемолиза. Торможение ИгМ-зависимого локального гемолиза анти-μ-сывороткой. В ходе приготовления верхнего слоя к ЭБ и лимфоидным клеткам в зоне агарозы добавляют 0,05 мл анти-μ-сыворотки в оптимальном разведении (конечное разведение-1 : 2000 и более). После 2-часовой инкубации при 37°С выявляются непрямые зоны гемолиза. Блокада IgM основана на специфическом взаимодействии с анти-μ-антителами, препятствующем образованию IgM-зависимых зон гемолиза. |