Главная

• Аллергия
• Клиническая иммунология
• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Простая радиальная иммунодиффузия

На плоской поверхности создают равномерный слой геля, содержащего антисыворотку. Из лунок, проштампованных в геле и заполненных раствором антигена, молекулы АГ диффундируют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующими AT. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится раствор антигена. Этот метод впервые описал Манчини (Mancini) в 1963 г. Известны многочисленные модификации этого метода, мы приводим описание, основанное на методике, изложенной в монографии Mayer и Walker.

Материалы и оборудование. Для работы необходимы моноспецифические антисыворотка, стандартные препараты, контрольные сыворотки, буферные растворы, агар, рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, измерительное устройство с точностью до 0,1 мм, микро-шприцы для внесения объемов 1—10 мкл.

Последовательность этапов исследования. Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера на водяной бане, охлаждают до 48 °С и смешивают с антисывороткой, желательно подогретой до той же температуры, в небольшой пропорции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35—40 °С. Золь агара, содержащий антитело, распределяется по поверхности предметного стекла и застывает слоем толщиной приблизительно 1 мм. Рекомендуют также наносить на предметные стекла по 1 мл горячего раствора агара (10 г/л) и высушивать их при 70 °С перед использованием. Если пластины для простой радиальной иммунодиффузии будут храниться перед употреблением в течение 2—3 недели (во влажной камере при 4°С), то к гелю добавляют консерванты (мертиолят, 0,1 г/л, азид натрия, 0,2 г/л). На предметном стекле в слое геля вырезают по 8 лунок при помощи отшлифованной стеклянной трубки, соединенной с водоструйным насосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной иммунодиффузия проводят во влажной камере. Если линии преципитации достаточно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В тех случаях, когда оценку проводят немедленно, пластинки с гелем отмывают 2—3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 часов. Этим достигается удаление непреципитировавших белков. После отмывки препараты высушивают и окрашивают, например, амидочерным 10 В. Последовательность операций представлена на рисунке:

Простая радиальная иммунодиффузия. Этапы работы

Калибровочная кривая

К моменту завершения диффузии наблюдается прямая линейная зависимость между исходной концентрацией антигена и площадью преципитата. Это можно видеть на примере графика определения IgA:

Простая радиальная иммунодиффузия. Кривая для определения IgA

D² — квадрат диаметра диффузии

Для построения графика берут логарифм концентрации антигена и как функцию от него площадь преципитата, квадрат диаметра зоны преципитации или логарифм диаметра преципитата. Во всех случаях зависимость носит линейный характер и описывается уравнением:

где S — общая площадь зоны преципитации, включая So, So — площадь стартовой лунки, Qa — площадь антигена.

Наклон прямой К находится в обратной зависимости от концентрации антител в геле:

Cat — концентрация антитела в геле, m — точка пересечения прямой с ординатой.

Снижая уровень антисыворотки в геле, можно последовательно увеличивать диаметр зоны преципитации. При этом К возрастает и увеличивается экономичность концентрации реагентов возможно только до определенных пределов, так как может возникнуть ослабление преципитации. В каждом отдельном случае концентрацию антисыворотки в геле подбирают в зависимости от титра антител. Обычно рекомендуют использовать 1—5% антисыворотки.

Температура и продолжительность иммунодиффузии

Температура существенно не влияет на результаты диффузии. Опыт можно ставить при 4°С, 20 °С или 37 °С. Обычно простую радиальную иммунодифузию проводят в холодильнике при 4—6°С с целью предупреждения роста грибов и бактерий. Следует избегать резких колебаний температуры (размах не более +5°С). Процесс иммунодиффузии при работе, например, с альбумином и ферритином, завершается через 48 ч; с IgG и IgA — через 2— 3 дня; с IgM, аг-макроглобулином и другими белками с крупными молекулами — через 5—7 дней. Первый ориентировочный замер диаметра преципитата можно получить уже через 4 ч. Существует модификация простой радиальной иммунодиффузия с постоянным временем диффузии, равным 24 часа. Это означает, что диффузия антигена по крайней мере при его высокой концентрации полностью не заканчивается. Получаемые результаты вполне сопоставимы с результатами простой линейной иммунодиффузии. Соответственно наблюдается линейная зависимость между логарифмом концентрации антигена и радиусом преципитации. Раньше считалось, что эта модификация уступает по чувствительности методу, предложенному Манчини. Недавние исследования указывают, что оба метода имеют одинаковую чувствительность.

Подготовка пластин для иммунодиффузии

Во избежание погрешностей следует обращать особое внимание на поддержание температуры расплавленного агара при внесении антисыворотки (48°С, максимально 50°С), на правильный расчет концентрации антисыворотка в геле, на количество агара, наносимое на каждую пластину, и на строго горизонтальное расположение пластины. Поскольку толщина слоя геля уменьшается по направлению к периферии пластины, то следует добиваться того, чтобы кольца преципитации располагались не ближе 5 мм от края.

Значение свойств антигена

Как правило, иммунохимические и физико-химические свойства стандартного и исследуемого антигенов должны быть сходны. Иногда это требование трудновыполнимо. Например, диффузионные свойства могут изменяться, когда молекулы антигена обладают склонностью к агрегации или, наоборот, к диссоциации. Это приводит к изменению условий диффузии, возможно даже к маскировке одних детерминант антигенов и демаскировке других. Тенденцию к агрегации можно наблюдать, в частности, в очищенных препаратах сывороточного альбумина после их повторного растворения. Если такой раствор предназначен для использования в качестве стандартного при калибровке, то агрегаты удаляют гельфильтрацией на сефадексе G-200. IgA содержится в сыворотке в виде молекул с различной степенью полимеризации. Обычно соотношение моно-, ди- и тримеров неизвестно. Приходится в данном случае ориентироваться на усредненные результаты анализов большого числа сывороток нормальных доноров или на существующие стандарты ВОЗ. В некоторых случаях завышенные результаты получаются вследствие преобладания быстро диффундирующих фрагментов (субъединиц). Это наблюдение справедливо для IgM, при работе с которым наблюдаются по меньшей мере две линии преципитации. Длительное хранение сывороток при 4°С может приводить к частичному распаду белков вследствие остаточной протеолитической активности.

Модификации метода

По различным причинам в стандартную методику приходится вводить ряд изменений. Для повышения чувствительности метода используют более толстые слои геля и более вместительные лунки для антигенов (до 20 мкл). Слабые преципитаты становятся лучше различимыми после обработки танином. Танин используют в концентрациях от 0,2 до 4% при рН 1,5. Усиление действия танина наблюдается при обработке неокрашенных препаратов раствором дигидроксифениланилина. Использование подобных приемов позволяет определять даже IgE у верхней границы нормальной концентрации. Усиление преципитации наблюдается при добавлении к смеси агароза —антисыворотка карбовакса 20 М в количестве до 20 г/л. Внесение неионных полимеров (полиэтиленгликоль, карбовакс, оксидвакс) в лунки для антигена или обработка пластин для иммунодиффузия антииммуноглобулиновой сывороткой также усиливает преципитацию. Некоторые изменения при постановке простой радиальной иммунодиффузии связаны с экономией антисыворотки.

Определенное небольшое количество антисыворотки до или после диффузии антигена наносится на область предполагаемой преципитации на поверхности геля. Антиген, диффундирующие радиально, и антитела, диффундирующие соответственно вертикально, встречаются в толще геля и образуют преципитаты. При этом следует избегать подогревания геля. Простая радиальная иммунодиффузия пригодна в равной мере для количественного и для качественного анализа иммунохимически близких белков. Если количество в лунках постоянно, можно судить о титре антитела в антисыворотках различных животных по величине колец преципитации при точно известном содержании антисыворотки в геле. Для определения титра антитела смешивают гель в установленной пропорции с антигеном, антитела диффундируют в гель (так называемая обратная радиальная иммунодиффузия). Радиус колец преципитации пропорционален титру. Вместо агара или агарозы в реакции простой радиальной иммунодиффузия можно использовать пленку ацетата целлюлозы. Разработан интересный вариант данного метода, позволяющий количественно оценить степень структурного сходства родственных антигенов.

Оценка метода

В пределах своей чувствительности простая радиальная иммунодиффузия пригодна для определения любых антигенов при условии, что имеются соответствующая моноспецифическая антисыворотка и чистые или стандартные антигены для калибровки системы.

Обычно ПРИД используют для определения белков в биологических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты различных органов и т. д.

Простая радиальная иммунодиффузия

а — определение IgG на пластинах 100X70 мм (препарат д-ра Linneke, Висмар);
б — определение IgM на предметных стеклах. Два противоположных резервуара на узких сторонах стерла служат для внесения контрольной пробы.

Этот метод прочно удерживается в лабораториях. Многие белки можно определять, используя коммерческие наборы стандартов или даже готовые иммунодиффузионные пластинки. Ошибка метода при работе с одной серией реагентов составляет 3—7% (литературные и собственные данные). Контрольные измерения изо дня в день в течение длительного времени дают коэффициент вариации 8—10% для оценки иммуноглобулин. Известно, что в норме содержание многих сывороточных белков сильно колеблется, например IgG от 8 до 18 г/л. С учетом этого средняя ошибка определения нижних границ концентрации составляет для сывороточного IgA— 18,3%, для IgG— 17,4%, для IgM—15,7%, для гаптоглобина—13,6%, для трансферрина — 9,8%. Соответствующие значения для верхней границы составляют 8,6%, 6,5%, 7,3%, 7,1% и 5,2% (60—70 измерений последовательно в течение 26 дней).

Необходимо помнить, что концентрации ИГ, определяемые методом простой радиальной иммунодиффузия у здоровых лиц, не укладываются в нормальную кривую распределения результатов; об этом следует помнить при статистической обработке данных. Относительно простая постановка опыта, несложное оборудование, надежность метода способствуют широкому использованию простой, радиальной иммунодиффузия. К числу недостатков метода следует отнести большую длительность реакции по сравнению с другими методами, в основе которых лежит образование иммунных преципитатов. С точки зрения клиницистов, например специалистов в области клинической иммунологии, этот недостаток не столь существен, поскольку ситуации, когда необходимо знать концентрацию иммуноглобулин в день взятия пробы, встречаются редко.