Главная

• Аллергия
• Клиническая иммунология
• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Иммуноэлектрофорез. Оценка метода

Иммуноэлектрофорез — один из широко распространенных методов качественного анализа антигенов. Располагая соответствующими преципитирующими АС, с его помощью можно исследовать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения. В клинике этот метод чаще всего используется при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. В судебной медицине с его помощью анализируют системы гаптоглобина и группоспецифического компонента Gc.

В научно-исследовательской работе иммуноэлектрофорез служит основным методом идентификации белков, содержащихся в сложных смесях. Он незаменим как метод последовательного наблюдения за процессом очистки белковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов. Естественно, что метод, имеющий столь широкое применение, должен был видоизменяться и совершенствоваться в различных направлениях. Были предложены новые носители: гель агарозы, ПААГ, ацетат-целлюлозные пленки.

Вместе с тем ИЭФ стали комбинировать с различными методами специфического окрашивания и флюорохромироваиия, чтобы выявлять ферменты, углеводы, липопротеиды, нуклеопротеиды. В результате комбинации с другими методами анализа возникли диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, радиоиммуноэлектрофорез и др. Для количественного определения с помощью полиспецифических АС недавно был предложен двухмерный ИЭФ. Особая модификация двухмерного ИЭФ может повысить его чувствительность до уровня РИА. Это достигается электрофоретической элюцией антигена из малых стеклянных резервуаров объемом 0,1—10 мл. Для ИЭФ с охлаждением Виме сконструировал прибор, автоматически поддерживающий постоянную температуру и силу тока в процессе разделения.

Устройство для проведения электрофореза в геле агара

Этот прибор очень удобен для определения электрофоретической подвижности различных веществ. Использование в этом приборе термоэлектрического охлаждения (батарея Пельтье) следует особенно рекомендовать в случае работы с ферментами и другими термолабильными веществами. Недавно был предложен простой способ разделения белков в двухмерном электрофорезе. Известен чувствительный способ определения непреципитирующих систем антиген-антитело, основанный на применении МКАТ, так называемый каскадный ИЭФ, включающий фиксацию АГ после электрофореза, присоединение к антигенам антител, удаление связанных антител и их количественная оценка.

В случае иммунофиксационного электрофореза разделяются AT, а не антиген. Это быстрый и экономичный метод, он особенно пригоден для массового обследования с целью выявления парапротеинемии и для получения препаратов белков. При ИЭФ нередко наблюдаются нарушения нормального течения процесса, и не всегда удается сразу обнаружить их причину. Если, например, используется недостаточно очищенный агар, но это чаще всего приводит к трем нарушениям: плохому образованию геля, сильному электросмосу, плохому обесцвечиванию препаратов. Недостаточно чистый агар всегда подлежит очистке. Приступая к работе с новой порцией агара, нужно сначала испытать его годность. Часто обнаруживается, что одни и те же антигены имеют разную электрофоретическую подвижность и по-разному окрашиваются при употреблении различных партий агара. Причиной нарушений при ИЭФ может быть гидролиз агара, вследствие многократного или слишком длительного нагревания.

О гидролизе свидетельствует ослабление гелеобразующих свойств и возникновение неровностей на поверхности геля. Электрофоретическое разделение может быть нарушено при использовании неподходящего буферного раствора. Большинство буферов служит хорошей питательной средой для бактерий и плесневых грибков. Поэтому запас буфера следует хранить в холодильнике или добавлять к нему консервант. Буфер, заполняющий электрофоретическую камеру, следует менять не реже одного раза в неделю. При многократном использовании электродного буфера необходимо после каждого разделения менять полюса электродов. Величина напряжения на клеммах камеры обычно не позволяет судить о физической силе тока, проходящего через гель, поэтому в цепь нужно последовательно включить миллиамперметр. В процессе разделения сила тока почти всегда повышается. Это явление обусловлено нагреванием геля, которое нарастает с увеличением продолжительности электрофореза.

Однако после первоначального подъема сила тока в цепи может упасть. Часто это происходит из-за подсыхания полосок фильтровальной бумаги, соединяющих гель с буфером, или даже из-за подсыхания самого геля. В этом случае следует уменьшить ионную силу буфера или напряжение на клеммах камеры. Кроме того, высыхание можно предотвратить, если перед электрофорезом обернуть пластинку геля и полоски бумаги полимерной пленкой. Удобнее всего работать с источником, который обеспечивает постоянную силу тока (стабилизация тока). Самой собой разумеется, что результаты ИЭФ зависят от качества антигенов и антисывороток.