| |
Главная |
Встречный электрофорез. МетодикаМатериалы и оборудование. Для работы можно использовать любое электрофоретическое устройство с регулируемым напряжением (до 300 В), например, камеру FK66 (Росток) или Цейссовский прибор для электрофореза; предметные стекла или стеклянные диапозитивные пластины 5х5 см, агар (например, Difco Agar Noble) или агарозу, или смесь агар — агароза; ацетат-целлюлозная мембрана (Sar-torius, Геттинген); трубки для вырезания лунок в геле, водоструйный насос для удаления вырезанных гелевых цилиндров; влажную камеру, фильтровальную бумагу для замыкания контактов геля с буфером. Антисыворотки (например, лошадиная анти-HBsAg сыворотка, анти-АФП сыворотка, Institut fiir Imf-stoffe (Дессау), Behringwerke (Марбург), буферные растворы, состав которых приводится ниже. Буферные растворы: А или Б Барбитал-натрий
9,75 г
8,142 г Приготовление геля Расплавляют 1,5 г агара, агарозы или смеси обоих веществ в 100 мл барбитал-ацетатного буфера на кипящей водяной бане. В качестве консерванта можно добавить 2 мл 0,1% раствора тиомерсала (мертиолята). Стеклянные пластины обезжиривают, слегка подогревают и наносят на них равномерным слоем агар из расчета 0,15 мл на 1 см2. После застывания геля на расстоянии около 7 мм друг от друга вырезают лунки диаметром 3 мм, гелевые цилиндры удаляют с помощью водоструйного насоса. Если одновременно хотят обнаружить антитела, то лунки вырезают триадами. Схема расположения лунок при проведении встречного иммуноэлектрофореза
А — место нанесения антигена, Б — место нанесения антисыворотки, В — место нанесения охарактеризованного антигена для выявления антител. В зависимости от цели исследования расположение лунок может быть и таким, как показано на рисунке; Схема расположения лунок для реагентов прн постановке ВИЭФ по Kohn
особое внимание следует обращать на точное соблюдение расстояний между лунками. Если лунки расположены так, как это показано на рисунке то, варьируя соотношение антиген—антитело и заполняя исследуемым образцом оба резервуара (без положительного контроля), можно наблюдать (соответственно избегать) феномен прозоны вследствие избытка антиген или антитело. При помощи пипетки в лунки с катодной стороны вносят антиген, с анодной — антисыворотку. Проведение электрофореза Оба отделения камеры для электрофореза заполняют барбитал-ацетатным буфером. Пластины с гелем укладывают в соответствии с расположением полюсов и замыкают электрическую цепь полосками бумаги, смоченной буферным раствором. При напряжении 150—200 В (3—4 мА на 1 см ширины агарового геля) продолжительность электрофореза составляет от 1 до 3 ч. Увеличивая напряжение до 300 В, можно сократить продолжительность электрофореза до 30 мин, но для этого необходимо обеспечить охлаждение камеры. В геле агара преципитаты HBsAg— анти-НВs-антитела образуются возле лунки с антисывороткой, в геле агарозы — посередине между лунками с антигеном и с антителом. Прецнпнтат НВз-антнген/анти-НВв-антитела в геле агарозы (большое увеличение)
АФП/анти-АФП преципитат в геле агара
а — антнсыворотка, б — исследуемая сыворотка, в — позитивная контрольная сыворотка Встречный иммуноэлектрофорез на ацетат-целлюлозных мембранах Смоченные в буферном растворе мембраны из ацетат-целлюлозы слегка высушивают фильтровальной бумагой, кладут их на три слоя фильтровальной бумаги и специальным штампом делают углубления, вмещающие 5 мкл жидкости. Эти углубления хорошо сохраняются при последующей обработке мембран и помогают точно определять положение полос преципитации. Напряжение 100 В позволяет завершить электрофорез за 20 мин. Линии преципитации на мембране не видны, для их визуализации необходимо окрашивание. Мембраны отмывают проточной водопроводной водой, окрашивают амидо черным 10 В или нигрозином и обесцвечивают водой. Весь процесс занимает не более 15 мин. ВИЭФ на ацетат-целлюлозных мембранах имеет несомненные преимущества при массовых обследованиях, так как расход антисыворотки составляет всего лишь 5 мкл на один анализ. |