Главная

Фотометрическое определение иммунных агрегатов. Методика

Материалы и оборудование. Фосфатно-солевой буфер: 11,9 г Na₂HP0₄-2H₂0 и 9,1 г NaH₂P0₄растворяют по отдельности в 1000 мл 0,15 М NaCl; 85,2 мл раствора Na₂HP0₄ доводят до 100 мл раствором NaH₂P0₄; получают буферный раствор с рН 7,5. Моноспецифическая сыворотка; стандартный раствор: стандартная сыворотка для лазерной нефелометрии с известным содержанием белка (смесь сывороток здоровых доноров, стабилизированная удалением термолабильных компонентов); фреон (C2CI3F3) для осветления мутных сывороток; центрифуга на 16 000 g; микрокюветы из синтетических материалов (кюветы Sarstedt для лазерной нефелометрии); лазерный нефелометр, например He-Ne лазерный нефелометр (Behring Werke, Марбург).

Построение стандартной кривой

Для каждого белка строят стандартную кривую на основе 5— 6 разведений. Лучше использовать геометрический ряд разведений стандартных сывороток для лазерной нефелометрии в фосфатно-солевом буфере с рН 7,5 от 1: 10 до 1:640. Для IgG и IgA используют разведения 1:20— 1:640, для IgM и С3с — 1: 10 — 1: 160. Коммерческие препараты АС для лазерной нефелометрии обычно разводят в соотношении 1:5 (50 мкл АС + + 200 мкл буфера) в сосудах, не содержащих даже следов пыли. Лучше использовать стеклянные сосуды, так как пластмассовая посуда притягивает пыль ввиду своих электростатических свойств. В измерительные кюветы вносят по 100 мкл разведенного стандартного раствора и по 200 мкл различных разведений сыворотки. В случае IgG берут только 10 мкл стандартного раствора. Образцы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем проводят измерения на лазерном нефелометре. Кюветы опускают в шахту нефелометра, данные считывают с цифрового табло.

Определение белка в сыворотке больных

Исследуемые сыворотки подвергаются осветлению (центрифугирование при 16000 g в течение 10 мин) и обработке фреоном (1 мл сыворотки смешивают с 1,5 мл фреона, перемешивают в горизонтальном направлении, центрифугируют 10 мин при 1000 g). Такая обработка приводит к получению относительно прозрачной сыворотки. Сыворотки разводят в отношении 1 + +100 (50 мкл сыворотки + 5 мл буфера). К 100 мкл разведенной сыворотки прибавляют 200 мкл, разведенной 1 + 4 антисыворотки. Смесь инкубируют в кюветах, проводят измерение.

Схема разведений и используемых объемов

Разведение стандарта Разведение АС Разведение
исследуемой сыворотки Объемы реагентов

стандарт или исследуемая сыворотка анти-сыворотка

IgG
1:20, 1,40, 1:80
1:60, 1:320,
1:640
1:100, 1:200,
1:400, 1:800,
1:1600
1 + 4

1 + 4

1 + 100

1 + 500

10 мкл

100 мкл

200 мкл

200 мкл

IgA
1:20, 1:40, 1:80
1:60, 1:320,
1 + 4
1 + 100
100 мкл
200 мкл

IgM
1:10, 1:20, 1:40
1:80, 1:160,
1 + 4
1 + 100
100 мкл
200 мкл

С3с
1:10, 1:20, 1:40
1:80, 1:160,
1 + 4
1 + 100
100 мкл
200 мкл

Оценка результатов

Получаемые на цифровом табло значения светорассеяния в вольтах и соответствующие значения концентраций стандартных растворов наносят на двойную логарифмическую или простую миллиметровую бумагу. Данные измерений образуют калибровочную кривую. На рисунках представлены калибровочные кривые для IgG и IgM.

Калибровочная кривая для IgG

Калибровочная кривая для IgM

Одной и той же калибровочной кривой можно пользоваться, пока работа осуществляется с одними и теми же реагентами. Рекомендуется все же контролировать измерения со стандартной сывороткой. Значения светорассеяния, полученные с исследуемыми сыворотками, переводят в концентрацию с учетом использованных разведений. Полученные значения должны находиться в средней части стандартной кривой, в противном случае приходится пользоваться другими разведениями.

Определение циркулирующих иммунных комплексов

Находящиеся в сыворотке иммунные комплексы могут быть определены при помощи преципитации полиэтиленгликоля 6000 (см. раздел Определение растворимых иммунных комплексов). Исследуемые образцы сывороток после обработки фреоном (см. выше) разводят боратным буфером в соотношении 1 + 2. Состав буфера: 6,7 г Н₃В0₃, 13,4 г Na₂B₄0₇-ЮН₂0 растворяют в 1000 мл Н₂0; рН 8,4. Смешивают 200 мкл разведенной сыворотки с 2 мл боратного буфера, во втором сосуде смешивают 200 мкл разведенной сыворотки с 2 мл боратного буфера, содержащего 4% полиэтиленгликоля 6000. Инкубируют 45 мин при комнатной температуре. Проводят измерения на лазерном нефелометре. Значения контроля (исследуемая сыворотка+ боратный буфер) не должны превышать 0,3 В. Значения светорассеяния в пробах, содержащих ПЭГ, соответствуют концентрации иммунных комплексов. Результаты можно оценивать косвенно по калибровочной кривой с искусственно полученными иммунными комплексами с известным содержанием белка. Чаще всего используют преципитирующие in vitro комплексыбычьий сывороточный альбумин— анти-БСА. Для получения таких комплексов смешивают равные количествабычьий сывороточный альбуминв 0,15 М NaCl и анти-БСА крысы, инкубируют в течение 30 минут при 37 °С и разводят в соответствии с геометрическим рядом.