| |
Главная |
Окрашивание как способ анализа преципитатовОкрашивание преципитатов в гелях повышает контрастность препарата, а также делает видимыми неразличимые невооруженным глазом преципитаты. Перед окрашиванием необходимо удалить из геля все белки, не имеющие отношения к формированию преципитатов (отмывка гелей 0,15 М NaCl). Окрашивание преципитатов позволяет получать более тонкую и дифференцированную характеристику антигенов (1 — белки, 2 — липопротеиды, 3 — гликопротеиды, полисахариды, нуклеопротеиды, металлопротеиды). Окрашивание белков Для выявления белков в составе преципитатов чаще всего используют амидо черный, световой зеленый, азокармин, пунцовый, нигрозин, кумасси синий и бромфеноловый синий. Большинство красящих растворов перед употреблением фильтруют. Продолжительность окрашивания зависит от толщины слоя геля, но оно редко длится более 10—20 минут. Обесцвечивание геля проводят до тех пор, пока участки геля, не содержащие белка, становятся совершенно прозрачными. Часто для обесцвечивания достаточно простой водопроводной воды. Амидо черный. Применяются как водные, так и спиртовые растворы.
Световой (светлый) зеленый. Краситель окрашивает y-глобулины почти так же интенсивно, как альбумины. Линии преципитации имеют ярко-зеленый цвет.
Азокармин. Этот вид окрашивания позволяет получать темно-красные полосы преципитации. Окрашивание очень стойкое, при фотографировании получаются контрастные снимки.
Пунцовый. Этот краситель окрашивает преципитаты в светло-красный цвет. Краситель особенно удобен для окрашивания преципитатов в условиях определения ферментативной активности.
Окрашивание липопротеидов Для выявления липопротеидов в преципитатах пригодны судан черный, жировой красный и нильский голубой. Необходимо, чтобы пластины геля были совершенно сухими; влажный гель плохо прокрашивается. Недостаточно высушенные препараты могут обусловливать выпадение неспецифического осадка краски, поскольку все вышеперечисленные красители водонерастворимы. Судан черный.
Смесь непродолжительное время кипятят, после остывания переливают в темную склянку с хорошо притертым горлышком. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор. Обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Жировой красный. Окрашивание этим красителем придает препарату незначительную контрастность. Липопротеиды окрашиваются в бледно-красный цвет.
После непродолжительного кипячения и охлаждения раствор фильтруют. В свежеприготовленном растворе пластины геля выдерживают несколько часов; обесцвечивают 70% этанолом. Одновременное окрашивание липопротеидов и белков. Комбинируя азокармин с суданом черным, можно за один цикл окрашивания получить белки в виде красных, а липопротеиды в виде темно-синих полос.
Обесцвечивание фона проводят 50% этанолом, содержащим 1% уксусную кислоту. Глико-, нуклео- и металлопротеиды По аналогии с электрофорезом на бумаге окрашивание углеводов можно проводить периодатным методом Шиффа. Разумеется, неоправданно применение агара в качестве носителя, поскольку он сам, будучи углеводом, дает положительную реакцию. Поэтому предпочтительнее использовать ацетат-целлюлозную мембрану. Нуклеопротеиды можно окрашивать пиронином Y. Продажные препараты пиронина содержат примеси, которые можно удалить многократной экстракцией хлороформом.
Высушенные пластины с гелем выдерживают в красящем растворе в течение 60 минут, фон обесцвечивают в ацетатном буфере. Преципитаты, содержащие нуклеопротеиды, окрашиваются в красный цвет. Выявление металлопротеидов. Преципитаты, содержащие ионы меди, окрашиваются ализариновым синим в синий цвет. Реакция специфична в отношении ионов.
Высушенные пластины с гелем помещают на 30 минут в красящий раствор. Обесцвечивают пластины 70% СН3СООН. Белки, содержащие ионы меди, окрашиваются в синий цвет. Железосодержащие белки, например сывороточный трансферрин или гемоглобинсвязывающие белки, выявляют при помощи реакций, сопровождающихся образованием берлинской лазури или бензидиновой пробой. |