Главная

Блоттинг по Саузерну

Одним из первых результатов, полученных с использованием клонов кДНК, явилось подтверждение следующих предсказаний гипотезы Дрейера—Беннет- та: а) существует один единственный ген и С-области, но б) множество генов V-области, в) в гаметной ДНК гены V и С расположены далеко друг от друга, и г) они существенно сближаются при активной экспрессии генетической информации в клетках х-секретирующей миеломы. Метод, с помощью которого эти данные были получены, получил название «блоттинга по Саузерну» и начиная с 1975 г., когда он был описан Саузерном, является одним из наиболее мощных инструментов молекулярного биолога.

Для того чтобы проиллюстрировать сказанное, представим клонированный в плазмиде гипотетический ген «X». Если плазмидную ДНК разрезать одной из рестриктаз, например Avail, то с помощью блоттинга по Саузерну можно получить ответ на вопрос: каков размер фрагмента ДНК, содержащего ген X? ДНК, гидролизованную Avail, наносят на агарозный гель и проводят электрофорез.

Этот мощный метод позволяет определить длину фрагмента ДНК, содержащего нужный ген (обозначен толстым черным прямоугольником).
Расщепленную рестриктазой ДНК наносят в стартовую лунку (черная полоса) агарозного геля и проводят электрофорез;
меньшие фрагменты движутся в геле с большей скоростью и разделяются по размеру на полосы, находящиеся на различных расстояниях от старта.
ДНК этих полос переносят на лист нитроцеллюлозы (внизу справа). Стопка сухих бумажных полотенец над фильтром просасывает буфер через гель
за счет капиллярных сил. Фрагменты ДНК при этом переносятся на фильтр и задерживаются на нем,
воспроизводя исходную картину разделенных полос. После фиксации ДНК на фильтре запеканием нитроцеллюлозу запаивают в пластиковый мешок
с радиоактивным зондом (точки), комплементарным гену. Фильтр отмывают от несвязавшегося
зонда и выдерживают его в контакте с рентгеновской пленкой, чтобы обнаружить радиоактивность, связанную с искомым геном.

При электрофорезе фрагменты ДНК в соответствии с их размером образуют четкие зоны — меньшие фрагменты движутся в геле быстрее. Кольцевая рекомбинантная плазмида, содержащая, например, пять участков узнавания Avail, будет разрезана на шесть фрагментов; после электрофореза фрагменты можно выявить с помощью ДНК, меченной флуоресцентным красителем — бромистым этидием, и сравнить их положение с положением полос, образованных в том же геле маркерными молекулами ДНК с известными размерами. Чтобы определить, какая из пяти полос содержит ген X, фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозный фильтр, при этом на нитроцеллюлозной копии сохраняется исходное относительное расположение полос. Затем ДНК фиксируют на фильтре и фильтр инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом, содержащим либо фрагмент гена X, либо высокогомологичную ему последовательность. Радиоактивный зонд связывается (или «гибридизуется») с фиксированной на фильтре ДНК, содержащей ген X, но не с другими фрагментами плазмидной ДНК. После тщательной промывки для удаления несвязавшегося зонда фильтр накладывают на чувствительную к рентгеновским лучам фотопленку и положение радиоактивной гибридизующейся полосы выявляют в виде пятна на радиоавтограмме. Наиболее впечатляющее достоинство этого метода состоит в том, что с его помощью в геномной ДНК, расщепленной Avail, можно обнаружить интересующий нас ген х, составляющий менее одной миллионной от всей нанесенной на гель ДНК, в то время как окраска бромистым этидием дает одно сплошное пятно (диффузный отпечаток).