Главная

Геномные гены V и С

После получения перестроенного гена представлялось интересным сравнить его с «родительским» гаметным геном Vx, подвергшимся перестройке в МОРС 41. При клонировании гаметного гена VM, однако, возникло затруднение— зонд, специфический к области Vx из МОРС41, мог гибридизоваться не только с истинным гаметным геном Fx, но и с другими гомологичными генами Vx, как это показано на двумерной картине блоттинга по Саузерну.

Вверху: картина двумерного переноса расщепленной EcoRI ДНК эмбрионов мыши (равноценная гаметной ДНК). Фрагменты фракционировали на
колонке RPC-5 и индивидуальные фракции наносили на отдельные дорожки агарозного геля. После электрофореза, переноса и гибридизации с зондом, вырезанным из
F-области клона кДНК МОРС41, было обнаружено около 10 различных полос, любая из которых могла содержать гаметный предшественник гена F. Для того чтобы
выявить полученную с RPC-5 фракцию, содержащую истинный ген- предшественник, гибридизующиеся фракции расщепляли дополнительно Kpnl, разделяли электрофорезом
и переносили на другой нитроцеллюлозный фильтр. В выделенном из ДНК МОРС41 перестроенном геномном клоне F 4- С имеется сайт расщепления Kpnl, расположенный
на расстоянии 1 тпн от 5'-концевого сайта расщепления EcoRI (см. схему внизу). Предполагая, что ген-предшественник должен содержать те же участки
расщепления EcoRI и Kpnl, Сейд- ман и др. ввели радиоактивную метку в EcoRI-Kpn I-фрагмент и гибридизовали его с описанным выше вторым фильтром (в центре)
в поисках фракции, содержащей фрагмент EcoRI-Kpn I, идентичный обнаруженному в перестроенном гене миеломы. Такой фрагмент был найден только во фракциях 8 и 9, и клонирование гаметного предшественника для гена F было проведено именно из этих фракций.

Для того чтобы найти истинный «родительский» ген VM, Сейдман и др. проверили методом Саузерна несколько различных фракций генома, содержащих гены V, гомологичные гену х МОРС41, используя характерный признак активно перестроенного гена МОРС41 — наличие рестрикционного фрагмента длиной 1 тпн между участками расщепления EcoRI и Kpnl, расположенными со стороны 5'-конца гена V, т. е. вне его последовательности. Этот фрагмент был обнаружен лишь в одной из геномных фракций. Из этой фракции и был клонирован гаметный ген V МОРС41.

В области, гомологичной для двух клонов, последовательность гаметного гена Вх МОРС41 точно совпала с последовательностью перестроенного гена. Эти данные противоречили гипотезе, объясняющей разнообразие Ig соматическими мутациями (в крайней ее форме), так как они показали, что по крайней мере некоторые из гаметных генов не подвержены таким мутациям и могут экспрессироваться в неизменном виде. Кроме того, эти данные наряду с другими противоречили модели «мини-генов», объясняющей разнообразие V-областей Ig тем, что гипервариабельные и каркасные участки V-области закодированы в гамет- ном геноме в виде отдельных отрезков.

Хотя последовательности нуклеотидов гаметного и перестроенного генов точно совпали, гомология между этими двумя генами резко обрывалась на ко- доне 95. Участок, включающий в себя остатки 96—108, всегда рассматриваемый как часть V-области и кодируемый неразрывно с основной ее частью в пере-? строенном гене, в гаметном V-клоне отсутствовал. Этот факт не был абсолютно неожиданным, так как ранее в лаборатории Тонегавы (Tonegawa) при изучении системы Я-генов мышей было показано, что аналогичный участок, названный J-областью (от англ. join — соединять), в гаметном гене кодируется вблизи 5'-конца С-области, а не вблизи гена V. Поскольку в перестроенном гене М0РС41 остатки J-области были закодированы на расстоянии 3,7 тпн от 5'-конца гена С, можно было ожидать, что эта область будет присутствовать на том же расстоянии от гена Сив гаметном клоне. Более того, так как обнаруженные в других перестроенных клонах х большие нитроны между областями V и С составляли по длине менее 3,7 тпн, можно было ожидать наличия и других фрагментов, кодирующих J-области, расположенных несколько ближе к гену С.

Когда были получены клоны гаметных генов С-областей и определена их нуклеотидная последовательность, оказалось, что существует пять /-сегментов; они разделены примерно 0,3 тпн и занимают участок, расположенный на расстоянии от 3,7 до 2,5 тпн от 5'-конца гена С. Сегменты J1, J2, J4 и J5 (нумерация начинается с гена J, наиболее удаленного от гена С) кодировали аминокислотные последовательности, найденные в одной или нескольких миеломных х- цепях мыши, первичные структуры которых были определены, и соответственно остатки с 97 по 108 всех х-цепей BALB/c совпадали с одним из этих четырех гаметных генов. С другой стороны, сегмент J3 кодировал последовательность, никогда не наблюдавшуюся в каппа-цепях. Более того, в отличие от четырех других генов / в гене J3 отсутствовал общий для всех генов сигнал сплайсинга, позволяющий удалять большой интрон при созревании РНК (обязательная, по-видимому, последовательность GT... была заменена на СТ...). По двум этим причинам считается, что сегмент J3 представляет собой нефункциональный J-сегмент.