Главная

Рекомбинация VDJ в Н-цепях мыши

Рекомбинация, приводящая к перемещению гаметного гена V Н-цепи в участок, сближенный с μC-областью, очень схожа с рекомбинацией V — J в случае L-цепей, но с одним важным отличием: в полученном в результате перестройки гене Н-цепи между V и J включен третий элемент — D (от английского diversity — разнообразие). Как следует из работы Шиллинга и др., о существовании такого элемента можно судить на основании определенных химически последовательностей аминокислот. Авторы составили таблицу опубликованных аминокислотных последовательностей Н-цепей, расположив их так, чтобы достигнуть максимальной гомологии. При этом выявился необычно вариабельный по последовательности и длине сегмент, соответствующий третьей гипервариабельной области. Участки, примыкающие к этому вариабельному сегменту из 0—8 аминокислот (максимально известное число — 14), были более консервативны и несли следы независимого подбора, т. е. рекомбинации независимых F- и J-областей (данная F-последовательность могла быть связана с различными J-последовательностями, и наоборот). Существование отдельного элемента D нашло подтверждение при сравнении нескольких перестроенных генов Н-цепей с их гаметными F- и J-предшественниками.

Гаметные клоны μ мыши изучались несколькими группами. При анализе нуклеотидных последовательностей было установлено, что они содержат четыре гена J-области на расстоянии около 5 тпн с 5'-стороны от кодирующей последовательности μ. Все четыре гена J, видимо, функциональны, так как все кодируемые ими аминокислотные последовательности были обнаружены в секретируемых Н-цепях (обратной закономерности не наблюдается: структура некоторых секретируемых Н- цепей свидетельствует о наличии точковых мутаций в их J-областях). Вблизи от 5'-концов всех четырех генов J были найдены гептамерный и нонамерный гомологичные элементы, ранее обнаруженные в J-генах L-цепей; расстояние между этими элементами составляло около 22 нуклеотидов.

Для детального изучения сайта рекомбинации было исследовано несколько перестроенных генов Н-цепей и гаметных предшественников генов V. В этих работах гаметный предшественник гена V получали путем скринирования фаговых клонов гаметной ДНК с помощью F-зондов, полученных из рекомбинированных генов. При блоттинге по Саузерну гаметной ДНК и гибридизации с этими зондами было получено несколько полос, что указывало на существование семейства родственных генов F, подобного семейству генов Fx. Выявление среди генов этого семейства гаметных предшественников конкретных рекомбинировавших F-областей основывалось на гомологии их 5'-фланкирующих участков и сравнении последовательности. Общее строение клонированных гаметных генов F оказалось сходным со структурой F-генов L-цепей; последовательность, кодирующая сигнальный петид из 19 остатков, прерывалась в кодоне —4 коротким интроном, остальная часть генов F-области была непрерывна. Вблизи 3'-конца кодирующей последовательности были обнаружены гептамерный и нонамерный сигнальные элементы, разделенные примерно 22 нуклеотидами.

При сравнении нуклеотидных последовательностей рекомбинированного гена и его предшественников V и J оказалось, что ни один из предшественников не кодирует фрагмента, расположенного в перестроенном гене между F и J. Таким образом, представление о закодированном независимо элементе D оказалось верным.

Для однозначного вывода о существовании гаметных D-областей недоставало только клонирования этих участков из гаметной ДНК, однако одно интересное предсказание об их структуре было высказано еще до получения этих клонов. Предсказание это касалось промежутка между гептамерами и нонамерами в .D-области. В генах F и J L-цепей расстояние между этими элементами составляло либо 11—12, либо 22—23 пн. Эти расстояния соответствуют приблизительно одному или двум виткам двойной спирали ДНК. Как было отмечено ранее, рекомбинация F — J как в к-, так и в Я-системах происходит между парой зародышевых предшественников, содержащих комбинацию из двух возможных спейсеров (правило 1+2 витков). Поскольку в системе генов Н-цепей промежутки между консервативными элементами составляли «2 витка» как у VH-t так и у Йн-генов, было предсказано, что зародышевая D-область должна содержать на обоих концах сигнальные элементы с промежутком в 1 виток. При этом рекомбинация как между V и D, так и между D и J должна подчиняться правилу 1+2 витков.

Обнаружить гаметный ген D с помощью зонда, вырезанного из клонированных перестроенных генов, было технически сложно, так как фрагмент ДНК, кодирующий несколько аминокислот D-области, слишком мал для того, чтобы служить сигналом гибридизации. Более эффективный зонд мог быть получен из нефункционального промежуточного продукта рекомбинации DJ, не успевшего прорекомбинировать с геном V. Такая структура, по предположению Сакано и др., должна была бы существовать в некоторых миеломах и могла оказаться удобным гибридизационным зондом, так как сохраняла бы 5'-фланкирующую последовательность гаметного гена D. О существовании нефункциональных перестроек генов Н-цепи свидетельствовал ряд данных, полученных при исследовании ряда миелом с помощью блоттинга по Саузерну и гибридизации со специфичным к JH зондом, согласно которым в большинстве случаев в миеломах нет неперестроенных гаметных полос, но есть одна, две и даже три перестроенные полосы. После клонирования одной из таких полос миеломы QUPC52 оказалось, что она содержит искомый аберрантный рекомбинант DJ. Гаметный предшественник этой области был обнаружен на расстоянии 0,7 тпн от 5'-конца JH1. Его структура оказалась весьма сходной с ожидаемой: к кодирующей последовательности из 10 нуклеотидов с обеих сторон прилегали гептамерный и нонамерный сигнальные элементы с промежутком между ними в «1 виток». Сходный клон, полученный из перестроенного JH в линии Г-клеток (SP2), был также использован в качестве второго зонда для клонирования Д-участка гаметной ДНК [61, 62]. При помощи зонда SP2 было выявлено семейство из девяти родственных D-областей, сгруппированных на участке длиной 60 тпн. Расстояние этого участка от гена D из QUPC52 неизвестно. Все гены семейства SP2 содержат кодирующую область из 17 нуклеотидов, а расстояние между сигнальными элементами в них соответствует «одному витку». Третий зонд D, названный FL16, был получен сходным образом и позволил выявить D-семейство, расположенное с 5'-стороны от семейства SP2. Семейство FL16 состоит, видимо, лишь из двух гаметных генов D, однако оно широко представлено в перестроенных генах Н-цепей, для которых известна последователь-ность.

В Областях большинства рекомбинировавших генов D при сравнении с гаметными D-областями обнаруживаются мутации, а во многих — от одного до четырех дополнительных нуклеотидов, не входящих в состав ни одного на гаметных предшественников. Эти дополнительные нуклеотиды либо добавляются в процессе перестройки генов, либо отражают существование пока не обнаруженных гаметных D-областей, сходных с тремя уже известными семействами. Некоторые из перестроенных генов Н-цепей содержат D-последовательности, настолько отличающиеся от известных гаметных последовательностей, что существование по крайней мере еще одного гаметного D-семейства весьма вероятно.

В кодирующей последовательности нескольких D-областей содержатся группы нуклеотидов, гомологичные гептамерному сигнальному элементу; этот внутренний гомолог гептамера расположен на расстоянии около «двух витков» от нонамеров, примыкающих с обеих сторон к гену D. Было высказано предположение, что благодаря таким промежуткам может происходить рекомбинация D — D, еще больше расширяющая разнообразие D-областей.