Главная

Иммунофармакологические подходы к процессингу антигена в макрофагах

В качестве экспериментальной модели в этих исследованиях использовали взаимодействие макрофагов с бактерией Listeria monocytogenes и последующую презентацию бактериальных белков или пептидов Т-клеткам, полученным от животных, иммунизированных Listeria. При этом определяли интенсивность прикрепления иммунных Т-клеток к монослою макрофагов, инкубированных с бактериями. Связывание Т-клеток с такими макрофагами начиналось после лаг-периода продолжительностью 30—60 мин от начала инкубации макрофагов с бактериями. Связывание и поглощение бактерий макрофагами происходило гораздо быстрее. Из этого следует, что одного лишь связывания недостаточно для создания ассоциированного с макрофагами иммуногена, необходимого для прикрепления Т-клеток. Процессинг антигена и его связывание можно разделить на основе их различной зависимости от температуры и энергии. Хотя связывание антигена макрофагами может происходить при 4°С или же в присутствии ингибиторов окислительного и гликолитического метаболизма, в этих условиях у макрофагов не развивается способность связывать антиген-специфические Т-клетки. Переработка бактерий, видимо, осуществляется аналогично процессингу растворимых белковых антигенов. Накопление иммунологически активного антигена происходит путем связывания антигена с мембраной и последующего зависящего от метаболизма процесса его переработки. Заметим, что кинетика катаболизма антигена тесно коррелирует с кинетикой образования вещества, связывающего Т-клетки. Появление способности связывать Т-клетки и катаболизм антигена подавляются при низкой температуре, истощении метаболической энергии и фиксации клеток альдегидами. Модель, предложенная Зиглером и Унэнью, включает 1) первоначальное взаимодействие бактерий Listeria с поверхностью макрофага, происходящее с участием трипсин- чувствительных рецепторов, 2) поглощение антигена в веде фагосом, 3) слияние фагосом с лизосомами и 4) протеолитическую деградацию антигена. Небольшие фрагменты антигена, образовавшиеся под действием лизосомных протеиназ, затем высвобождаются и переносятся на поверхность макрофага в ходе процесса, напоминающего экзоцитоз.

Убедительное подтверждение этой последовательности событий было получено в экспериментах с применением двух лизосомотропных агентов — ионов аммония и хлороквина. Действие этих соединений сводится к нарушению нормального функционирования лизосом путем повышения лизосомного рН, а в результате и к подавлению активности кислых гидролаз. Хлороквин непосредственно ингибирует активность катепсина В.1, а ионы аммония тормозят слияние фагосом и лизосом; оба агента ингибируют также рециркуляцию рецепторов. Ни хлороквин, ни хлорид аммония не подавляют поглощения макрофагами убитых нагреванием клеток Listeria. В то же время катаболизм бактерий, меченных ¹²⁵I, ингибировался на 40—60%, о чем свидетельствовало уменьшение количества кислоторастворимой метки в культуральной среде. Вторая функция макрофагов, ослабляемая этими агентами,— презентация антигена. Если ионы аммония или хлороквин добавляли в среду за 30 мин до добавления бактерий, то антиген-специфическое связывание с макрофагами иммунных Т-клеток значительно подавлялось.

Угнетение презентации антигена хлороквином и NH₄Cl

Метод оценки	Контроль	NH₄Cl (10 мМ)	Хлороквин (0,1 мМ)
Связывание антигена Поглощение антигена Катаболизм антигена Связывание Т-клеток с макрофагами	15 66 29	13 63 13	15 67 14
до обработки антигена после обработки антигена	70 84	26 70	30 64

Если же макрофаги взаимодействовали с бактериями до добавления этих агентов в течение 30 мин при 37°С, то степень подавления была небольшой.

Из этих результатов был сделан вывод, что ингибирующие эффекты использованных агентов связаны с их действием на процесс переработки антигена макрофагами, имеющий более важное значение для возникновения, чем для поддержания антигенности макрофагов. Ослабление способности презентировать антиген строго коррелировало с избирательным подавлением его катаболизма. По-видимому, для презентации иммуногенов Т-клеткам необходим внутриклеточный процессинг молекул антигена. Возможно, что после расщепления антигена в лизосомах его фрагменты переносятся на доступные участки клеточной поверхности или выделяются во внеклеточную среду. Исходя из этих данных легко понять, почему антигенные детерминанты белков, распознаваемые Т-клетками, представлены денатурированными участками белков; подобные модификации белков, по всей видимости, происходят в результате их частичного расщепления в лизосомах.

Описанный выше подход был использован при изучении переработки растворимого глобулярного белкового антигена KLH макрофагами и клетками В-лимфомы. Чтобы выявить процесс презентации антигена, и клетки В-лимфомы, и макрофаги, связавшие KLH при 4° С, необходимо было в течение 45—60 мин инкубировать при 37°С. По-видимому, это время требовалось для неких активных процессов, необходимых для экспонирования антигена. В данных исследованиях активацию Т-клеток оценивали по индукции секреции ИЛ-2 антиген-специфическими Т-клеточными гибридомами. Условия, необходимые для активации этих антиген-специфических опухолевых линий, по всей видимости, отличались от условий активации нормальных иммунизированных Т-лимфоцитов: оказалось, что В-клетки и макрофаги можно зафиксировать перед добавлением к культуре Т-клеток.

Антиген, связавшийся с поверхностью презентирующих клеток при 4°С, был чувствителен к расщеплению проназой. Однако после инкубации при 37°С антиген-презентирующая активность клеток не подавлялась под действием протеиназы — очевидно, антиген поглощался клетками, попадая в участок, недоступный для протеиназ. Этот результат согласуется с описанными выше данными, полученными при исследовании макрофагов морской свинки, инкубированных с ДНФ-АМС. Если клетки В-лимфомы или макрофаги инкубировали с KLH в течение 2 ч при 37°С, обрабатывали проназой, а затем фиксировали параформальдегидом, то они теряли способность презентировать KLH. В то же время нефиксированные обработанные проназой клетки презентировали KLH так же эффективно, как и контрольные клетки, не подвергавшиеся воздействию протеиназы. Был сделан вывод, что эти результаты убедительно свидетельствуют о реэкспрессии на клеточной поверхности поглощенного антигена: если после обработки проназой клетки фиксировали, то реэкспрессии не происходило и клетки не презентировали антигена.

Хлороквин подавлял презентацию KLH и В-клетками, и макрофагами. Он действовал при этом только на процессинг антигена, а не на другие функции презентирующих клеток, необходимые для активации Т-клеток: В-клетки не теряли способности презентировать антиген, поглощенный до инкубации с хлороквином.

Угнетение презентации антигена хлороквином

Первая инкубация с антигеном	Обработка хлороквином после первой инкубации	Вторая инкубация с антигеном	Синтез ИЛ-2 Т-клеточными гибридомами, Ед.
			ОВА-специфическая	KLH-специфическая
ОВА ОВА ОВА	- - +	- KLH KLH	640 640 640	0 320 0

Эти результаты также согласуются с предположением о том, что хлороквин действует на этап переработки антигена, предшествующий экспрессии процессированного антигена на клеточной поверхности. Во всех этих экспериментах В-лимфомы и макрофаги реагировали одинаково.

В другой работе сравнивали судьбу радиоактивно-меченных белков после их связывания с поверхностью макрофагов и В-клеток. В макрофагах радиоактивно- меченные овальбумин (ОВА) и KLH быстро распадались до кисло- торастворимых пептидов; вероятно, их катаболизм происходил в лизосомах, так как процесс деградации в значительной степени ингибировался хлороквином. В отличие от этого деградация KLH в клетках В-лимфомы была незначительной, причем имевший место небольшой катаболизм не подавлялся хлороквином. Поэтому нельзя исключить, что способность хлороквина подавлять презентацию антигена не связана с ингибированием протеолитического действия лизосомных ферментов, а вызвана его действием на другие клеточные процессы, например на рециркуляцию рецепторов. Макрофаги связывали в 10—20 раз больше KLH, чем В-клеточные опухоли, хотя эти два типа презентирующих клеток не отличались по количеству антигена, требующегося им для активации Т-клеточной гибридомы в культуре. Эти данные показывают, что большие различия между клетками этих двух типов в их способности связывать антиген могут не иметь отношения к связыванию иммунологически активного антигена. Возможно, высокий уровень нротеолитической активности макрофагов, приводящий к распаду большей части связанного антигена на пептиды и аминокислоты, компенсирует повышенное поглощение антигена этими клетками и приводит к тому, что опухолевые В-клетки и макрофаги обладают примерно одинаковой способностью к презентации антигена.