| |
Главная |
Иммуноферментный анализИммуноферментный анализ. Методика Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на том же принципе, что и РИА, только вместо радиоактивной метки применяется ферментная. Метод иммуноферментного анализа был предложен в начале 70-х годов тремя независимыми группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. Антиген или антитело, вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определять минимальные количества вещества (нанограммы). Известно много вариантов постановки иммуноферментного анализа. Различают гомогенный и гетерогенный вариант иммуноферментного анализа. В основе гомогенного иммуноферментного анализа, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента при соединении его с гаптеном (активность фермента восстанавливается в результате реакции антиген-антитело) либо, наоборот, потеря активности маркерного фермента в результате реакции антиген-антитело. Поэтому удаление свободного антигена из смеси, содержащей антиген в связанном виде, в составе иммунных комплексов невозможно. В противоположность этому при гетерогенном иммуноферментном анализе антигена или антитела фиксируется па твердой фазе (как правило, пластик), а непрореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием. Варианты методики В РИА, так же как в ИФА, различают методы конкурентного и неконкурентного анализа. Конкурентный метод Если существует необходимость количественного определения антигена, который может быть получен в чистом виде, то адекватный анализ при помощи конъюгата антиген-фермент и фиксированных на твердой фазе антитела может быть проведен в форме конкурентного взаимодействия. Схема конкурентного иммуноферментного анализа, антитела сорбированы на твердой фазе, антиген мечей ферментом
1—антитела, связывание с твердой фазой; 2— отмывка; Первым этапом в этом случае будет присоединение антитела к носителю за счет химической реакции или физико-химических взаимодействий. Избыток антитела удаляют отмыванием и, внося строго определенное количество меченого антигена и различные количества немеченого антигена, строят калибровочную кривую. По окончании реакции антиген-антитело иммунные комплексы оказываются присоединенными к твердой фазе за счет антитела; избыток антигена удаляют отмывкой, добавляют субстрат для фермента, останавливают реакцию по истечении определенного времени и проводят колориметрическое определение продуктов ферментативной реакции. В другом варианте конкурентного иммуноферментного анализа с твердой фазой первично связывается антиген. После отмывки добавляют меченые энзимом антитела и стандартный или исследуемый антиген. Связывание меченых антител конкурентно тормозится растворенным антигеном. Количество продуктов ферментативной реакции обратно пропорционально концентрации растворенного антигена. Схема конкурентного иммуноферментного анализа, антиген сорбирован на твердой фазе, антитела мечены ферментом
1—связывание антигена с твердой фазой; 2 — отмывка; Этот метод может включать использование второго энзим-меченого антитела, специфичного по отношению к IgG, первично реагирующему с фиксированным на твердой фазе антигена. Неконкурентные методы К числу неконкурентных методов относится метод двойных антител, или, как его иногда называют, «сэндвич-метод». Схема «сэндвич-иммуноферментного анализа» (метод двойных антител для определения антигена)
1—антитела, связывание с твердой фазой; 2— отмывка; 3 — инкубация
с пробой, содержащей антиген; Фиксированные на твердой фазе антитела инкубируют со стандартным или анализируемым антигеном. После отмывания добавляют избыток меченых антител (специфичных к этому же антигену), несвязавшиеся антитела отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного антигена. Довольно часто используют немеченые вторые антитела; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых антител, специфичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые антитела должны принадлежать животным разных видов. Для иммуноферментного определения антител часто используется непрямой, неконкурентный иммуноферментный анализ. Схема непрямого ИФА для определения антител при помощи ферментмеченого антиглобулина
1 — связывание антигена с твердой фазой; 2 — отмывкай 3 —
инкубация с пробой, содержащей антитела; Антиген фиксируют на твердой фазе, после отмывания проводят инкубацию с раствором антитела. Если произошло специфическое связывание антител, их можно количественно определить при помощи меченой ферментом антиглобулиновой сыворотки, ферментативной реакции. Прочие неконкурентные методы ИФА представляют собой различные модификации конкурентного метода. Вместо совместной инкубации меченых и немеченых антигенов со связанными антителами можно непосредственно инкубировать только стандартный или анализируемый антиген, а затем после отмывания проводить инкубацию с избытком энзим-меченого антигена, который взаимодействует с «незанятыми» антителами. Кроме того, стандартный или анализируемый антигеном можно инкубировать с избытком энзим-меченых антител и по окончании иммунной реакции добавлять эту смесь к антигену, фиксированному на твердой фазе. Определяют количество свободных энзим-меченых антител, связанных антигеном на твердой фазе. В обоих случаях концентрация продукта ферментативной реакции пропорциональна концентрации анализируемого антигена. |