Главная

• Аллергия
• Клиническая иммунология
• Антитела
• Реакция антиген-антитело
• Клетки иммунной системы
• История иммунологии
• Иммунохимия
• Продукты на страже иммунитета
• Вакцины
• Общие и частные проблемы иммунологии
• Основы иммунологии

Селекция гибридных клеток на среде ГАТ

Слившиеся клетки аккуратно ресуспендируют в 40 мл среды ГАТ. К этой суспензии для поддержания роста добавляют 1х10⁷ свежевыделенных ядерных клеток селезенки (см. раздел "Получение антителообразующих лимфоцитов"). Можно также применять перитонеальные макрофаги, получаемые смывом раствора глюкозы. Как показывают наши наблюдения, нет необходимости облучать поддерживающие клетки дозой в 2 Дж/кг (200 рад), хотя некоторые авторы это рекомендуют. Из суспензии клеток отбирают 192 пробы по 200 мкл и вносят их в плоскодонные планшеты для микрокультуральных работ. Культуры клеток инкубируют в водонасыщенной атмосфере, содержащей 5% СО₂ при 37 °С. Начиная с 4-го дня после слияния, производят замену половины надосадочной фракции в лунках с культурой свежей порцией среды ГАТ; замену повторяют каждые 3 или 4 дня. Для этого половину надосадочной фракции клеточной культуры аккуратно отсасывают стерильными пастеровскими пипетками, соединенными с водоструйным насосом.

Под действием гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) дефектные по ГГФРТ плазмоцитомные клетки отмирают. Остаются неслившиеся клетки селезенки и гибридомы, образовавшиеся из клеток плазмоцитомы и ГГФРТ-положительных лимфоцитов. Скорость деления клеток селезенки невелика, в то время как скорость деления гибридных клеток примерно такая же, как у клеток плазмоцитомы, поэтому быстрорастущие клоны гибридом становятся различимы в виде плотных колоний клеток.

Рекомендуется как можно раньше заносить в протокол количество растущих гибридных клонов, поскольку позднее это становится затруднительным из-за слияния отдельных клонов и образования дочерних колоний. Подсчет количества клонов гибридных клеток лучше всего производить при помощи инвертированного микроскопа Televal на 6-й день, а затем незадолго до проверки антителообразующей способности (с 15-го до 18-й день). В обычных условиях частота слияний составляет 10^-5 (образуется 1 гибридная клетка на 10⁵ исходных клеток плазмоцитомы), что соответствует образованию 1 гибридного клона в 1 культуральной лунке. При оптимальных условиях достигается частота слияний, равная 10^-4.