| |
Главная |
Определение антителопродуцирующей способности гибридомОпределение моноклональных антител к растворимым антигенам при помощи радиоиммунологического анализаОпределение моноклональных антител к поверхностным антигенам методом радиоиммунологического связывания При обычных условиях культивирования через 2—3 недели количество клеток в гибридном клоне достигает величины, делающей возможной определение антител. Из культуральных лунок отбирают при помощи автоматической пипетки по 50 мкл надосадочной фракции. Для обнаружения антител можно использовать любой высокочувствительный метод. Наиболее оправдал себя на практике метод, представленный на рисунке: Гибридомная технология: выявление антител, клонирование, массовое культивирование, культивирование
Определение моноклональных антител к растворимым антигенам при помощи радиоиммунологического анализаA. Гибкие планшеты для микротитрования (V-образные) или штампованные поливинилхлоридные (ПВХ) листы для упаковки таблеток «нагружают антигеном». Для этого углубления в ПВХ-листах заполняют на 2—12 часов раствором антигена при комнатной температуре. Концентрация антигена может составлять от 5 до 200 мг/л. Раствор антигена может использоваться для «нагрузки» много раз, при этом следует учитывать, что разведенные растворы истощаются быстрее. Б. Нагруженные ПВХ-листы трижды отмывают 0,15 М NaCl. B. Внесением нейтрального белка (10 г/л человеческого или бычьего сывороточного альбумина, разведенного в соотношении 1: 100 сывороткой плода коров или нормальной лошадиной сыворотки) «закрывают» те участки поверхности носителя, с которыми не связался антиген. Г. Трижды проводят отмывку 0,15 NaCl. После высушивания на воздухе ПВХ-листы, нагруженные антигеном, могут несколько месяцев храниться при 4°С без потери связывающей активности. Е. Надосадочную жидкость в количестве 50 мкл из культуральной лунки вносят в лунку, содержащую антиген. В качестве контроля используют надосадочные фракции культур клеток селезенки, плазмоцитомы или, если возможно, гибридных клеток, продуцирующих антитела другой специфичности. Листы с антигеном выдерживают 2 часа при 4 °С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа для выравнивания значений рН со значением рН надосадочных фракций. Ж. Троекратно отмывают ПВХ-листы холодным 0,15 М NaCl. 3. Связанные мышиные антитела определяют при помощи специфического кроличьего антимышиного ИГ, меченного 125I, который вносят по 50 мкл в лунку (около 20 000 имп/лунку). К раствору антител добавляют человеческий сывороточный альбумин до 10 мг/мл. ПВХ-листы инкубируют в течение 4—18 часов при 4°С. Дальнейшие операции проводят в соответствии с пунктом Ж-И. Отмытые ПВХ-листы разрезают и определяют связанную радиоактивность в каждой лунке с помощью автоматического гамма-счетчика. Антителообразующими гибридомами считают те, которые продуцируют надосадочные фракции, связывающие по меньшей мере в 4 раза больше радиоактивного антимышнного ИГ, чем надосадочные фракции контрольных проб. РИА для определения AT, продуцируемых гибридомами
Определение моноклональных антител к поверхностным антигенам методом радиоиммунологического связыванияА. Гибкие ПВХ-планшеты для микротитрования (лунки U-образной формы) заполняют разведенной 1:100 сывороткой (сыворотка плода коров или лошадей), инкубируют 30 минут при комнатной температуре и трижды отмывают 0,15 М NaCl. Б. В каждую лунку вносят по 5х105 клеток (например, лимфоциты крови) в 50 мкл раствора NaCl; планшеты центрифугируют при 300 g в течение 5 минут. В каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5% глютарового альдегида. В этом растворе клетки могут сохраняться в течение нескольких недель при 4°С. Перед употреблением клетки трижды отмывают раствором NaCl, в течение 2 ч инкубируют с ЧСА (10 г/л) и еще раз троекратно отмывают раствором NaCl. В. Вносят по 50 мкл надосадочной фракции клеточных культур или контрольного образца. Остальные этапы см. в разделе "Определение моноклональных антител к растворимым антигенам при помощи радиоиммунологического анализа". Вместо меченных изотопами антител можно использовать конъюгированные с ферментами антитела для иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). В качестве альтернативы можно применять другие разновидности РИА: локальный гемолиз в геле (смотри "Метод локального гемолиза"), нейтрализацию фагов и непрямую флюоресценцию. |