| |
Главная |
Метод локального гемолизаПроведение
исследования Метод локального гемолиза используется для выявления клеток, образующих антитела. Метод позволяет осуществлять количественные исследования сложного процесса образования В-лимфоцитами антител in vivo и in vitro. Лимфоциты лимфоидных органов, периферической крови или культур клеток смешивают с густой суспензией индикаторных эритроцитов, распределяют суспензию тонким слоем и иммобилизуют ее. При последующей инкубации плазматические клетки синтезируют антитела, которые диффундируют в окружающую среду и фиксируются на эритроцитах. В присутствии комплемента происходит лизис красных кровяных клеток. Образуются зоны гемолиза — светлые крупные пятна (иногда их называют бляшками), различимые невооруженным глазом:
В центре каждой зоны гемолиза находится АОК — антителообразующая клетка.
В целом число антителообразующих клеток соответствует числу зон гемолиза. Если известно количество внесенных ядросодержащих клеток (лимфоциты), то можно определить число антителообразующих клеток на 106 клеток исследуемого лимфоидного органа. Метод локального гемолиза (ЛГ) позволяет обнаружить и точно определить количество антителообразующих клеток в большой популяции лимфоцитов. Этим так называемым прямым методом определяют клетки, образующие IgM-антитела, высокоэффективные при гемолизе (см. рисунок а). Прямой и непрямой методы локального гемолиза в геле
(а) прямой метод локального гемолиза в геле Клетки, не секретирующие IgM-антитела, могут быть обнаружены так называемым непрямым методом с антииммуноглобулиновой сывороткой, так называемой «проявляющей» сывороткой (см. рисунок б). Антииммуноглобулиновые антитела связываются с секретированными антителами, фиксированными на эритроцитах. Наличие IgG-ан-тииммуноглобулиновых комплексов на мембране эритроцитов способствует гемолизу в присутствии комплемента. Количество «непрямых» антителообразующих клеток можно определить по разности данных, полученных прямым и непрямым методами. Точные методы определения антителообразующих клеток, синтезирующие Ig, не относящиеся к классу IgM, будут описаны ниже. При помощи метода локального гемолиза можно обнаружить не только антителообразующие клетки синтезирующие Ig против эритроцитарных антигенов, но и выявлять клетки, продуцирующие антитела к белкам, бактериальным полисахаридам и гаптенам, если использовать индикаторные эритроциты, на мембране которых сорбированы соответствующие антигены. Эритроциты подвергаются пассивному лизису после образования комплексов антиген-антитело на их поверхности. Используя эритроциты с фиксированным на их поверхности протеином А из золотистого стафилококка или антитела к IgG в качестве проявляющей сыворотки, можно обнаружить любые Иг-пpодуцирующие клетки, независимо от их специфичности (поликлональная В-лимфоцинарная реакция). Поскольку в отличие от оригинального метода поликлональные антитела обнаруживают при помощи протеина А и антител, конъюгированных с эритроцитами, эта модификация получила название непрямого локального гемолия. Подстановка локального гемолиза может сильно варьировать в зависимости от используемых добавок или носителей. Модификации метода локального гемолиза
Обе важнейшие модификации локального гемолиза представлены на рисунке: Модификации локального гемолиза (вверху) и метод Gunningham (внизу)
вверху - стандартный метод |