| |
Главная |
Получение моноклональных антител путем слияния клетокМатериалы и
оборудование Количество возможных вариантов антител у млекопитающих очень велико, оно составляет приблизительно 1•107. К одной детерминанте может образовываться до 8000 вариантов молекул антител. В условиях обычного иммунного ответа из всего видового потенциала антител у данного индивида образуется небольшое количество типов антител, представляющих собой случайную выборку из числа всех возможных вариантов. В связи с этим невозможно получить сыворотки от различных индивидов, обладающие одинаковым набором антител. В случае сложных антигенов, например ксеногенных клеток, иммунный ответ наблюдается в отношении приблизительно ста поверхностных антигенов, каждый из которых обладает несколькими детерминантами. Учитывая случайный выбор вариантов антител к каждой отдельной детерминанте, становится понятным, что антисыворотки от двух разных особей могут довольно сильно отличаться между собой. Невозможность воспроизвести на другом животном набор антител, получаемых от какого-либо определенного животного, сильно осложняет процесс стандартизации сывороток. Для получения сывороток против отдельных детерминант ксеногенных клеток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, что часто приводит к выделению антисывороток с крайне низким титром антител. Эти недостатки можно устранить, применяя моноклональные антитела к определенным клеточным детерминантам; моноклональные антитела продуцируются постоянно культивируемыми линиями клеток. В 1975 г. Кёлер и Мильштейн впервые добились слияния короткоживущих лимфоцитов, продуцирующих антитела, и постоянно растущих клеток плазмоцитомы. Это открытие дало возможность получать теоретические «бессмертные», непрерывно культивируемые клоны гибридных клеток — продуцентов антител (гибридомы). Образуемые гибридомами моноклональные антитела имеют сходное молекулярное строение и обладают одинаковой специфичностью. Первоначально слияние проводили при помощи вируса Сендай. Применение полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве агента, стимулирующего этот процесс, позволило существенно увеличить частоту слияний. Неслившиеся лимфоциты отмирают через несколько дней после гибридизации. Отделение неслившихся плазмоцитомных клеток от гибридом возможно только при использовании селективной среды ГАТ. Предпосылкой для ГАТ-зависимой селекции является наличие вариантов плазмоцитомных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (ГТФРТ) или по тимидинкиназе (ТК). Эти клетки отмирают в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), поскольку не обладают способностью обойти аминоптериновый блок основного пути биосинтеза ДНК за счет биосинтеза гипоксантина и тимидина. Механизм селекции на среде ГАТ
Только гибридные клетки, полученные слиянием ГГФРТ-негативных или ТК-негативных плазмоцитомных клеток и нормальных лимфоцитов (ГГФРТ- и ТК-позитивных), выживают в среде ГАТ, преодолевая аминоптериновый блок. Дефектные по ГГФРТ линии плазмоцитом получают путем селекции клеток, резистентных к 8-азагуанину. Линии, дефектные по ТК, выделяют по резистентности к 5-бром-дезоксиуридину. Среди растущих на среде гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ) гибридом выделяют и селекционируют те клоны, которые продуцируют иммуноглобулины (Ig) нужного класса и определенной специфичности. Выявленные антителопродуцирующие клоны гибридных клеток (гибридомы) можно культивировать in vivo и in vitro, в зависимости от этого моноклональные антитела получают из асцитической жидкости или из надосадочной фракции культуральной среды. |